豬巨細(xì)胞病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法的建立及其在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用.pdf

1、豬巨細(xì)胞病毒(Porcine cytomegalovirus，PCMV)可引起仔豬包涵體鼻炎，流產(chǎn)或者新生仔豬死亡。目前，該病毒已廣泛存在于世界各地，其血清陽(yáng)性率均可達(dá)90％以上。由于PCMV體外培養(yǎng)技術(shù)尚不成熟，對(duì)PCMV的研究相對(duì)較少，國(guó)外的研究主要集中在異種器官移植，研究表明，潛在的PCMV可在異種器官移植中被激活，并在此期間大量的繁殖，從而產(chǎn)生免疫抑制;在體外，PCMV的感染可激活內(nèi)皮細(xì)胞而產(chǎn)生消耗性凝血障礙，但其在體內(nèi)能否產(chǎn)生

2、相應(yīng)的作用還有待證實(shí)。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一種恒溫核酸擴(kuò)增方法，只需在恒溫條件下保溫幾十分鐘就可快速完成核酸的擴(kuò)增，可用于病原的快速檢測(cè)。本研究擬針對(duì)PCMV gB基因建立檢測(cè)豬巨細(xì)胞病毒的LAMP方法，結(jié)果顯示可用于新型PCMV檢測(cè)試劑盒的研發(fā)，以期能夠?qū)CMV進(jìn)行快速、簡(jiǎn)便的檢測(cè)。本研究還利用所建方法開(kāi)展了對(duì)四川省多地區(qū)PCMV分子流行病

3、學(xué)調(diào)查，調(diào)查結(jié)果對(duì)PCMV綜合防控及凈化與異種器官移植的選擇等具有重要意義。
　　本實(shí)驗(yàn)對(duì)PCMV gB基因進(jìn)行了以下研究:
　　1.豬巨細(xì)胞病毒的環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法的建立
　　設(shè)計(jì)LAMP引物，并對(duì)反應(yīng)體系與條件進(jìn)行優(yōu)化，確定了LAMP最佳反應(yīng)體系為:8U Bst DNA聚合酶;2.5μL Bst DNA聚合酶緩沖液(200 mM Tris-HCl(pH8.8),100 mM KCl,100 mM(NH4)2S

4、O4,1％ TritonⅩ-100）;3.0mM硫酸鎂;1M甜菜堿;600μM的dNTP(各2.5mM);0.25μM的PCMV-F3和PCMV-B3;2μM的PCMV-FIP和PCMV-BIP;0.5μL pMD19-gB重組質(zhì)粒;LAMP最佳反應(yīng)條件為:于電熱恒溫水浴鍋中65℃反應(yīng)60 min，后于80℃10 min終止反應(yīng)。LAMP方法的特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示，僅PCMV產(chǎn)生特異性條帶，說(shuō)明所建的LAMP方法具有高度的特異性。LAMP

5、方法的敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，LAMP的檢測(cè)靈敏度為1.0×107倍稀釋?zhuān)Ｒ?guī)PCR方法檢測(cè)極限靈敏度為1.0×106倍稀釋?zhuān)砻鱈AMP方法的檢測(cè)靈敏度是常規(guī)PCR檢測(cè)方法的10倍。
　　2.以L(fǎng)AMP方法與PCR方法同時(shí)對(duì)待檢的136份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，其結(jié)果表明PCMV在中國(guó)四川地區(qū)的感染率可達(dá)66.2％(90/136)，其中尤以哺乳仔豬感染率最高73.5％(39/53)，其次是種母豬為67.3％(33/49)，而種公豬的感染

6、率相對(duì)較低，為30.8％(14/21)。
　　3.本試驗(yàn)同時(shí)還以PCR/RT-PCR方法對(duì)四川省部分地區(qū)豬巨細(xì)胞病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、偽狂犬病毒與豬瘟病毒的混合感染情況進(jìn)行了調(diào)查，結(jié)果顯示PCMV與上述其他病毒的混合感染率可達(dá)80％(72/90)，其中與PRRSV的混合感染可能性最高，為41.9％(57/136)。而三種病毒同時(shí)感染的病例中尤以PCMV、PRRSV、CSFV混合感染可能性最高，可達(dá)11.8％(16/136)