基于RNa-Seq技術(shù)對(duì)臍橙果皮光澤型芽變果實(shí)發(fā)育期間蠟質(zhì)合成及轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的研究.pdf

1、以紐荷爾臍橙果皮光澤型突變體和母本紐荷爾臍橙果皮為實(shí)驗(yàn)材料，提取兩者RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-Seq)，結(jié)合課題組前期對(duì)兩者果皮蠟質(zhì)成分差異分析結(jié)果，篩選果實(shí)發(fā)育期間可能的差異表達(dá)途徑以及差異表達(dá)基因，運(yùn)用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)篩選到的差異表達(dá)基因進(jìn)行驗(yàn)證，并對(duì)可能的關(guān)鍵基因進(jìn)行克隆，從分子水平探討了紐荷爾臍橙果皮光澤型突變體和母本紐荷爾臍橙之間的差異，為改良臍橙品質(zhì)奠定了理論基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:
　　1.借助Illumin

2、a HiSeqTM2000測(cè)序平臺(tái)，對(duì)紐荷爾臍橙光澤型突變體果皮和母本紐荷爾臍橙果皮RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，測(cè)序結(jié)果如下:
　　(1)得到總reads共計(jì)77，339，480條，其中MT38，734，326條，WT38，605，154條?；蚋采w度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)顯示MT與WT中覆蓋度在80％以上的均占到17％。
　　(2)得到差異表達(dá)基因4，959個(gè)（FDR≤0.001且差異倍數(shù)在2倍及以上），WT與MT相比，發(fā)生相對(duì)上調(diào)基因1，5

3、42個(gè)，發(fā)生相對(duì)下調(diào)基因3，417個(gè)。
　　(3)GO功能顯著性富集分析將差異表達(dá)基因注釋到三大功能條目:細(xì)胞組分、分子功能和生物過程。其中細(xì)胞器、催化活性功能和細(xì)胞過程所占比例最大，分別占到三個(gè)功能條目的76.7％，68.7％，74.7％。
　　(4)KEGG數(shù)據(jù)庫將差異基因富集到124條Pathway，其中富集最大的是代謝途徑747(23.22％)，其次是次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成452(14.05％)。
　　(5)優(yōu)化

4、了9，296個(gè)基因注釋結(jié)構(gòu)，補(bǔ)充或延長(zhǎng)了它們3'UTR或5'UTR。
　　(6)發(fā)現(xiàn)新轉(zhuǎn)錄本438個(gè)，其中MT216個(gè)，WT222個(gè)。438個(gè)新轉(zhuǎn)錄本中具有編譯能力的有75個(gè)，其中MT41個(gè)，WT34個(gè)。
　　(7)MT和WT中分別有707和607個(gè)基因發(fā)生可變剪接，其形式為IntronRetention。
　　(8)發(fā)現(xiàn)SNP共計(jì)84，090個(gè)，其中MT44，389個(gè)，WT39，701個(gè)。
　　2.結(jié)合RNA-

5、Seq數(shù)據(jù)與課題組前期紐荷爾臍橙果皮光澤型突變體和母本紐荷爾臍橙果皮蠟質(zhì)差異成分分析結(jié)果，篩選蠟質(zhì)合成相關(guān)差異表達(dá)途徑，從中隨機(jī)選取差異表達(dá)基因并對(duì)其在果實(shí)發(fā)育期間相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行測(cè)量，在基因?qū)用娼忉尲~荷爾臍橙果皮光澤型突變體和母本紐荷爾臍橙果皮蠟質(zhì)成分差異原因，結(jié)果如下:
　　(1)本實(shí)驗(yàn)篩選了相關(guān)差異表達(dá)途徑6條，從中隨機(jī)選取16個(gè)差異表達(dá)基因，屬于7個(gè)基因家族。其中表達(dá)量相對(duì)上調(diào)基因3個(gè)，表達(dá)量相對(duì)下調(diào)基因13個(gè)。利用RT-q

6、PCR技術(shù)對(duì)16個(gè)差異表達(dá)基因在果實(shí)發(fā)育期間相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行測(cè)量，13個(gè)基因在果實(shí)整個(gè)發(fā)育期間連續(xù)表達(dá)，3個(gè)基因在發(fā)育期間間斷性表達(dá)。16個(gè)差異表達(dá)基因中有12個(gè)與測(cè)序結(jié)果相一致，表明RNA-Seq測(cè)序結(jié)果準(zhǔn)確可靠。
　　(2)對(duì)比差異表達(dá)基因RT-qPCR結(jié)果與課題組前期紐荷爾臍橙果皮光澤型突變體和母本紐荷爾臍橙成熟時(shí)期果皮蠟質(zhì)差異成分分析結(jié)果，兩者結(jié)果完全一致。
　　3.利用RT-PCR技術(shù)和基因克隆技術(shù)對(duì)紐荷爾臍橙果皮光

7、澤型突變體(MT)和普通紐荷爾臍(WT)果皮CER1基因家族Cs4g02580，Cs1g02760基因，KCS基因家族Cs4g06430基因進(jìn)行克隆，分別將其命名為CER1-1，CER1-2，KCS-1。分析結(jié)果如下:
　　(1)CER1-1 cDNA序列全長(zhǎng)1，492bp，包含一個(gè)1，275bp的開放閱讀框，編碼424個(gè)氨基酸，MT與WT相比，CER1-1氨基酸序列有11個(gè)位點(diǎn)發(fā)生突變。
　　(2)CER1-2-MT cD