鈣調(diào)蛋白抑制劑W-7對NMDA誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷及癲癇動(dòng)物模型的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制.pdf

1、目的： 1.觀察鈣調(diào)蛋白抑制劑N-(6-氨基己烷基)-5-氯-1萘-黃胺(W-7)對N-甲基-D-天冬氨酸(N-Methyl-D-aspartate，NMDA)誘導(dǎo)的體外培養(yǎng)的乳鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。 2.觀察鈣調(diào)蛋白抑制劑W-7對戊四唑(Pentylenetetrazol，PTZ)誘導(dǎo)的癲癇大鼠模型的保護(hù)作用及機(jī)制. 方法： 第一部分：取原代培養(yǎng)7天的乳鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元隨機(jī)分為5組：(1

2、)正常對照組：僅用杜氏改良低糖型F12培養(yǎng)基(Dilbecco’s modified eagle medium/F12，DMEM/F12)完全培養(yǎng)基。(2)NMDA損傷組：去除正常神經(jīng)元培養(yǎng)液，加入NMDA50μmol/L，處理時(shí)間10min。(3)3個(gè)劑量的W-7保護(hù)組：分別為保護(hù)組-1：25μmol/L，保護(hù)組-2：50μmol/L，保護(hù)組-3：100μmol/L，先加入W-7，培養(yǎng)24h后加入NMDA50μmol/L.MTT法檢測

3、細(xì)胞存活力；在熒光顯微鏡下觀察皮質(zhì)神經(jīng)元的形態(tài)；丫啶橙染色檢測凋亡細(xì)胞數(shù)量；檢測培養(yǎng)上清液中乳酸脫氫酶(Lactic acid dehydrogenase，LDH)含量；用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法及免疫印記法檢測皮質(zhì)神經(jīng)元內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子kB(Nuclear factorkappa B，NF-kB)p65、p38半胱氨酸基天冬氨酸(Cysteiyl aspartate specificproteinase，MAPK)蛋白的表達(dá)。 第二部分

4、：健康SD大鼠38只，隨機(jī)分為5組，對照組(腹腔注射生理鹽水)、PTZ組(腹腔注射PTZ)和三個(gè)劑量的W-7組(腹腔注射PTZ和W-7).觀察行為學(xué)表現(xiàn)；腦組織中LDH含量測定；HE染色觀察神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)改變；免疫組織化學(xué)方法和免疫印記方法檢測海馬組織NF-kBp65.p38MAPK和半胱氨酸基天冬氨酸(Cysteiyl aspartate specific proteinase，caspase)-3蛋白表達(dá)的變化. 結(jié)果：

5、 第一部分：(1)同對照組比較，NMDA損傷組神經(jīng)元凋亡增加(P＜0.01)，W-7組減少，呈劑量依賴性(P＜0.05).(2)NMDA組培養(yǎng)上清液中LDH含量高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；W-7干預(yù)組LDH含量低于NMDA組，差異均有顯著性意義(P＜0.05)；(3)NMDA組NF-kB、p38MAPK蛋白表達(dá)增加(P＜0.01)，W-7干預(yù)組表達(dá)減少，呈劑量依賴性(P＜0.05，P＜0.01)。 第二部分

6、：PTZ誘導(dǎo)的癲癇大鼠發(fā)作程度為Ⅳ-Ⅴ級(jí)，W-7保護(hù)組發(fā)作程度明顯減輕，表現(xiàn)為Ⅰ-Ⅲ級(jí)發(fā)作(P＜0.05)。PTZ組腦組織LDH含量較對照組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，W-7保護(hù)組同PTZ組比較，LDH含量明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，免疫組織化學(xué)染色和免疫印記實(shí)驗(yàn)顯示，PTZ組caspase-3，NF-kBp65和p38MAPK蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)(P＜0.01)，三個(gè)劑量的W-7組表達(dá)明顯減弱，其差異均具有

7、顯著性意義(P＜0.05，P＜0.01). 結(jié)論： 1.NMDA導(dǎo)致體外培養(yǎng)的乳鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元NF-kBp65、p38MAPK蛋白表達(dá)增高，促進(jìn)神經(jīng)元凋亡. 2.不同濃度的鈣調(diào)蛋白抑制劑W-7可減輕NMDA誘導(dǎo)的皮質(zhì)神經(jīng)元的損傷，具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制是通過抑制NF-kBp65、p38MAPK的蛋白表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。 3.PTZ導(dǎo)致癲癇大鼠模型腦組織中caspase-3，NF-kBp65和p38MAPK蛋白