建立穩(wěn)定抑制DAPK表達(dá)的PC12細(xì)胞株.pdf

1、【目的】 本研究利用RNA干擾(RNAi)技術(shù)，以死亡相關(guān)蛋白激酶(DAPK)的mRNA 為靶點，構(gòu)建一個使DAPK表達(dá)沉默的質(zhì)粒，并將這些帶有干擾序列的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞，篩選穩(wěn)定抑制DAPK表達(dá)的細(xì)胞株，同時觀察這些細(xì)胞株的生長特性，為后續(xù)的實驗研究提供基礎(chǔ)。 【方法】 首先構(gòu)建一株帶有紅色熒光蛋白和U6啟動子的質(zhì)粒載體。借助網(wǎng)絡(luò)設(shè)計工具，從DAPK基因的開放讀碼框架中篩選了4個干擾位點，經(jīng)過BLAST

2、檢查確定與其他基因沒有同源性。人工合成上述4對正反義脫氧寡核苷酸鏈，經(jīng)過退火形成dsDNA，定向克隆到構(gòu)建好的質(zhì)粒載體上，通過DNA測序鑒定重組結(jié)果。大量擴增重組質(zhì)粒并用質(zhì)粒提取試劑盒提純質(zhì)粒，利用脂質(zhì)體將帶有干擾序列的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至PC12細(xì)胞中，同時轉(zhuǎn)染一株空載質(zhì)粒作為空白對照。然后通過G418篩選細(xì)胞克隆，建立穩(wěn)定增殖細(xì)胞株。再用Western blot檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞DAPK表達(dá)量的變化，用MTT法測轉(zhuǎn)染細(xì)胞的生長曲線，用流式細(xì)胞術(shù)

3、檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞生長周期變化。然后用NGF和乙醇協(xié)同誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化，觀察其形態(tài)特征。 【結(jié)果】 測序結(jié)果顯示，U6 和四條干擾序列均已成功插入 pDsRed1-N1 質(zhì)粒載體中，最終形成 pDsRed1-N1-U6-shRNAs 干擾質(zhì)粒，分別命名為 F1、F2、F3、F4。在擴增和純化后，各質(zhì)粒經(jīng) Sofast<'TM>基因轉(zhuǎn)染試劑分別轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞。G418篩選和熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示，各質(zhì)粒均已成功轉(zhuǎn)染進

4、PC12細(xì)胞并長出細(xì)胞克隆。Western blot 結(jié)果顯示，F(xiàn)2，F(xiàn)3，F(xiàn)4 干擾序列對DAPK的表達(dá)均有降低作用，其中以F2干擾序列的作用效果最為明顯。令人意外的是，F(xiàn)1干擾序列使DAPK的表達(dá)明顯增加。MTT結(jié)果顯示，干擾序列對細(xì)胞株的生長增殖均具有促進作用，其中以轉(zhuǎn)染F2干擾序列的細(xì)胞株增殖最為明顯。同時，流式細(xì)胞術(shù)檢測正常生長PC12細(xì)胞，對照組細(xì)胞和轉(zhuǎn)染F2干擾序列細(xì)胞結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染F2干擾序列的細(xì)胞株 S 期的比例明顯增

5、加。NGF 和乙醇協(xié)同誘導(dǎo)細(xì)胞株向神經(jīng)細(xì)胞分化，顯微鏡觀察顯示，到第七天時，各株細(xì)胞均已分化成較為成熟的神經(jīng)細(xì)胞。 【結(jié)論】 成功構(gòu)建帶有紅色熒光蛋白和U6啟動子的質(zhì)粒載體，同時將四條干擾序列順利插入質(zhì)粒載體中，然后成功轉(zhuǎn)染到PC12細(xì)胞和篩選出單克隆細(xì)胞株。從實驗結(jié)果來看，RNA干擾技術(shù)能有效降低DAPK的表達(dá)，對細(xì)胞的增殖有一定的促進作用。同時，CMV和U6兩個啟動子相安無事，并沒有產(chǎn)生相互干擾作用。最后，NGF和乙