富含不同陽離子氨基酸抗菌肽的表達及其生物學活性研究.pdf

1、眾所周知，在抗生素大量使用甚至濫用的今天，細菌對抗生素產(chǎn)生廣泛的耐藥性是醫(yī)療行業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)比較頭痛的問題，雖然隨著科技的進步尤其是分子生物學技術的發(fā)展，許多新藥以越來越快的速度被開發(fā)出來，但事實表明，新藥的開發(fā)速度遠遠低于細菌產(chǎn)生抗藥性的速度，因而目前出現(xiàn)的現(xiàn)象就是新藥使用越來越多，而細菌耐藥性的產(chǎn)生也越來越快。所以當務之急是尋找和開發(fā)細菌不易產(chǎn)生耐藥性的藥物.抗菌肽就是其中的一個亮點，研究表明，細菌對抗菌肽不易產(chǎn)生抗藥性，抗菌肽對很多耐

2、藥性菌株都非常有效，因此將抗菌肽開發(fā)為抗菌藥物成為當今研究的熱門課題。
　　 目前已知的抗菌肽大部分是天然分離或人工合成的，含量少且成本高，這對于抗菌肽發(fā)展成為臨床應用產(chǎn)品是極不現(xiàn)實的。而且天然的抗菌肽殺菌活較低，有的對哺乳動物細胞還有一定的毒性。許多學者已經(jīng)進行了大量的研究來提高抗菌肽的活性并降低其毒性。本研究將幾種富含不同氧基酸的抗菌肽串連表達，以期作為復合抗菌肽研究其生物學活性，試驗內容及結果如下：
　　 1選取G

3、enbank中的Protegrin-1、4kD Scorpion Defensin、Metalnikowin-ⅡA、SMAP-29、Thanatin和Moronecidin抗菌肽序列，它們富含不同的氨基酸，S MAP-29、Thanatin、Protegrin-1、4 kda Scorpion Defensin富含精氨酸或賴氨酸，Metalnikowin-ⅡA則富含脯氨酸、Moronecidin則富含組氨酸。將上述抗菌肽核苷酸序列用酵母

4、的Kex2酶裂解位點識別序列（gagaaaaga）串聯(lián)起來，并根據(jù)酵母偏好密碼子對其進行改造，設計成復合抗菌肽cp基因，克隆到酵母表達載體pPICZa-A中，轉化入巴斯德畢赤酵母受體菌X-33中誘導表達.Tricine-SDS-PAGE檢測表明抗菌肽獲得了表達，表達量為271μg/mL.體外抑菌試驗檢測表明表達的復合抗菌肽CP可以耐受至少30分鐘的高溫，在pH6～8時最穩(wěn)定，酸對其活性影響較堿小，對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度為1.62

5、4μg/mL，135.5μg/mL的復合抗菌肽對小鼠紅細胞的溶血率為3.47％。
　　 2為了研究復合抗菌肽CP的抗菌活性及毒性，又從六種抗菌肽中選取MetalnikowinⅡ A（MET）和Scorpion Defensin（SD）分別在酵母中表達。參照酵母偏愛密碼子表，推導兩種抗菌肽的核苷酸序列，并對它們的C端進行改造，分別用TD-PCR和PCR法獲得目的基因，在巴斯德畢赤酵母中進行表達。結果表明，成功表達了上述兩種抗菌肽，

6、表達量分別為223μg/mL和131μg/mL。復合抗菌肽CP與它們相比活性比它們高3～7倍，而在熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性上CP和MET相似，都可以耐受至少30分鐘的高溫，在pH6～8時最穩(wěn)定，酸堿對它們均有影響，相比之下，堿的影響較大。復合抗菌肽CP的溶血率處于MET和SD兩者之間。
　　 3為了研究抗菌肽與抗生素之間的聯(lián)合藥效，為臨床減少抗生素的使用提供理論依據(jù)，選取幾種臨床常用的抗生素藥物（青霉素、鏈霉素、卡那霉素，環(huán)丙沙星，

7、新霉素、四環(huán)素、多粘菌素B、諾氟沙星、頭孢菌素），分別測定它們的最小抑菌濃度（MIC），初步探討3種抗菌肽分別與它們結合后的抗菌活性，并采用分級抑制濃度指數(shù)（FIC）來定量檢測抗菌肽與抗生素之間的抗菌作用關系。結果發(fā)現(xiàn)，抗菌肽和抗生素對不同細菌的抗菌活性不同，三種抗菌肽與不同抗生素之間的抗菌協(xié)同關系因細菌種類而不同，三種抗菌肽與卡那霉素、鏈霉素、四環(huán)素及多粘菌素B聯(lián)用對幾種細菌都有不同程度的協(xié)同或相加作用，而與青霉素等抗生素則是不相關甚

8、至拮抗關系，說明抗菌肽與抗生素之間并不是都存在協(xié)同關系，抗菌肽、抗生素與細菌三者的相互作用關系比較復雜，有待進一步研究。
　　 4為了研究復合抗菌肽CP對ICR小鼠生長和免疫機能的影響，將180只ICR小鼠隨機分為復合抗菌肽CP高、中、低劑量組，PBS對照組，空載體對照組及抗生素環(huán)丙沙星對照組。試驗期35天，各組小鼠給藥途徑均為口服。期間觀察小鼠體重、采食量，第0、7、14、21、28、35天稱重，各組隨機取3只，眼球采血致死，

9、稱脾和胸腺重，取血清測定細胞因子IL-2、IL-4及IFN-γ的含量。結果發(fā)現(xiàn)，各組全期平均日增重分別為0.644、0.638、0.62、0.63、0.632、0.614g/只，CP低、中劑量組增重高于PBS對照組，但差異不顯著（P>0.05），與其他各組相比差異也不顯著（P>0.05）；各組的料重比分別為7.66:1，7.52:1、8.71:1、7.84:1、7.87:1、8.16:1，低、中劑量抗菌肽組與PBS對照組相比，料重比明顯

10、降低，差異極顯著（P<0.01）。低中劑量復合抗菌肽CP組的胸腺和脾臟指數(shù)都呈增高趨勢，淋巴細胞增殖試驗表明，抗菌肽各劑量組都高于PBS對照組，差異均極顯著（P<0.01），與空載體對照組相比，低劑量組差異極顯著（P<0.01）?？咕牡椭袆┝拷MIFN-γ和IL-2值與PBS對照組相比均有升高，而IL-4有所下降，三個劑量組抗菌肽都可以部分提供細菌感染保護作用，低劑量組保護率最高。結果表明，合適劑量的抗菌肽可以提高飼料轉化率，促進小鼠淋

11、巴細胞增殖，保護小鼠抗細菌感染。
　　 5研究復合抗菌肽CP對ICR小鼠腸道菌群及腸道吸收能力的影響，提供抗菌肽的臨床應用安全依據(jù)。將180只ICR小鼠分為復合抗菌肽CP高、中、低劑量組，同時設PBS對照組，空載體對照組和環(huán)丙沙星對照組。每隔一周采集小鼠十二指腸、空腸段于固定于4％甲醛溶液中，制作組織切片檢測雞十二指腸和空腸的絨毛長度和隱窩深度，計算絨毛長度和隱窩深度比值（V/C），并于第35天取直腸內容物分離細菌。結果顯示，抗

12、菌肽試驗組各種腸道菌的數(shù)量均低于對照組，且隨劑量增加數(shù)量越少；試驗第0天，各組小鼠十二指腸絨毛、隱窩深度及V/C值基本相同，差異不顯著（P>0.05）；到第35天，A、B、E組小腸絨毛長度，V/C值高于對照組，差異極顯著（P<0.01），隱窩深度低于對照組，差異極顯著（P<0.01），C組小腸絨毛長度及V/C值低于對照組，隱窩深度高于對照組，差異極顯著（P<0.01）。說明抗菌肽可以影響腸道菌群，但適當劑量可改善小鼠腸道吸收能力，提高小