CXCL12在大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后所起作用的研究.pdf

1、第一部分CXCL12增加Bcl-2/Bax的比率抑制大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后皮質(zhì)神經(jīng)元的凋亡
　　目的:
　　探討CXCL12對大鼠創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)后皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響及相關(guān)機(jī)制。
　　方法:
　　1.采用顱腦液壓損傷裝置，制備大鼠創(chuàng)傷性腦損傷模型;
　　2.將實(shí)驗(yàn)大鼠分成四組:假手術(shù)組只開顱，不制備腦損傷模型，不注射任何試劑;對照組在損傷區(qū)周圍皮質(zhì)注射生理鹽水;CXCL12治療組注射CXCL12，CX

2、CL12+AMD3100治療組注射CXCL12+AMD3100。
　　3.傷后3天，TUNEL試劑盒檢測各組神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況，TUNEL/NeuN、TUNEL/GFAP熒光雙標(biāo)檢測凋亡細(xì)胞類型，CXCR4/NeuN免疫熒光雙標(biāo)檢測凋亡神經(jīng)元CXCR4的表達(dá)情況，active caspase-3/NeuN、active caspase-3/GFAP、Bcl-2/NeuN、Bcl-2/GFAP、Bax/NeuN、Bax/GFAP免疫熒

3、光雙標(biāo)檢測各組active caspase-3、Bcl-2、Bax的陽性細(xì)胞比例及所屬細(xì)胞類型。
　　4.Western Blot檢測各組active caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)變化。
　　5.實(shí)時(shí)PCR檢測各組active caspase-3、Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)變化。
　　結(jié)果:
　　1.TBI后損傷區(qū)周圍皮質(zhì)出現(xiàn)的凋亡細(xì)胞以神經(jīng)元為主，且凋亡的神經(jīng)元可表達(dá)CXCR4;給予CX

4、CL12治療，相較于對照組，CXCL12下調(diào)了損傷區(qū)周圍皮質(zhì)神經(jīng)元的凋亡指數(shù)(AI)，CXCL12+AMD3100治療組與CXCL12治療組比較AI重新升高，但仍低于對照組。
　　2.Caspase-3免疫熒光、Western Blot及實(shí)時(shí)PCR等結(jié)果為:CXCL12治療組與對照組比較，active caspase-3表達(dá)下調(diào)，CXCL12+AMD3100治療組與CXCL12治療組比較active caspase-3重新升高，但

5、仍低于對照組。
　　3.Bcl-2、Bax免疫熒光、Western Blot及實(shí)時(shí)PCR等結(jié)果為:CXCL12治療組與對照組比較，Bcl-2表達(dá)上調(diào)，CXCL12+AMD3100治療組與CXCL12治療組比較Bcl-2有所下降，但仍高于對照組;CXCL12治療組與對照組比較，Bax表達(dá)下調(diào)，CXCL12+AMD3100治療組與CXCL12治療組比較Bax有所上升，但仍低于對照組;CXCL12治療組與對照組比較，Bcl-2/Bax比

6、率升高，CXCL12+AMD3100治療組與CXCL12治療組比較Bcl-2/Bax比率有所下降，但仍高于對照組。
　　結(jié)論:
　　大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后，給予CXCL12能抑制損傷區(qū)周圍皮質(zhì)神經(jīng)元的凋亡，其作用機(jī)制與CXCL12/CXCR4軸提高Bcl-2/Bax比率，進(jìn)而減少caspase-3的活化有關(guān)，而active caspase-3的減少，使得凋亡級聯(lián)放大過程減輕，從而使得TBI后的神經(jīng)元得以保護(hù)。
　　第二部分

7、CXCL12促進(jìn)大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后神經(jīng)前體細(xì)胞增殖及遷移
　　目的:
　　探討CXCL12對大鼠創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)后損傷區(qū)周圍腦組織的神經(jīng)前體細(xì)胞增殖、遷移的影響及相關(guān)機(jī)制。
　　方法:
　　1.采用顱腦液壓損傷裝置，制備大鼠創(chuàng)傷性腦損傷模型;
　　2.將實(shí)驗(yàn)大鼠分成四組:假手術(shù)組只開顱，不制備腦損傷模型，不注射任何試劑;對照組在損傷區(qū)周圍皮質(zhì)注射生理鹽水;CXCL12治療組注射CXCL12，CXCL1

8、2+AMD3100治療組注射CXCL12+AMD3100。
　　3.傷后7天，檢測BrdU/Nestin、BLBP/Nestin、BLBP/Vimentin、BLBP/SOX2、BLBP/CXCR4、DCX/BLBP、DCX/BrdU、DCX/GFAP、DCX/NeuN、MMP-2/DCX、MMP-2/GFAP、MMP-2/NeuN免疫熒光雙標(biāo)情況;檢測CXCR4/ DCX免疫熒光雙標(biāo)情況及所占面積;檢測MMP-2免疫熒光標(biāo)記情況

9、。
　　4.Western Blot檢測各組Nestin、BLBP、Vimentin、MMP-2蛋白表達(dá)變化。
　　5.實(shí)時(shí)PCR檢測各組Nestin、BLBP、Vimentin、MMP-2 mRNA表達(dá)變化。
　　6.體外培養(yǎng)胚鼠海馬源性神經(jīng)干細(xì)胞，BrdU/Nestin、SOX2/CXCR4免疫熒光檢測其胚源性及增殖能力，GFAP、MAP-2、CNP檢測其多分化潛能。
　　7.將神經(jīng)干細(xì)胞分成三組進(jìn)行分化培養(yǎng)

10、，對照組中加入TBI腦組織提取液，CXCL12組加入TBI腦組織提取液和CXCL12，CXCL12+AMD3100組加入TBI腦組織提取液、CXCL12和AMD3100。DCX免疫熒光檢測各組神經(jīng)干細(xì)胞向DCX陽性細(xì)胞分化的比例。
　　結(jié)果:
　　1.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)免疫熒光結(jié)果為:CXCL12治療組與對照組比較，在損傷區(qū)周圍皮質(zhì)及胼胝體部位BrdU/Nestin、BLBP/Nestin、BLBP/Vimentin雙標(biāo)陽性細(xì)胞增多，

11、CXCL12+AMD3100治療組與CXCL12治療組比較這些雙標(biāo)陽性細(xì)胞明顯下降且低于對照組。Western Blot以及實(shí)時(shí)PCR結(jié)果與免疫熒光結(jié)果類似，Nestin、BLBP、Vimentin蛋白和mRNA的表達(dá)在給予CXCL12后明顯升高，給予CXCL12+AMD3100后表達(dá)則下降且低于對照組。
　　2.損傷區(qū)周圍皮質(zhì)BLBP/Vimentin雙標(biāo)陽性細(xì)胞形態(tài)類似星形膠質(zhì)細(xì)胞，而胼胝體部位BLBP/Vimentin雙標(biāo)陽

12、性細(xì)胞大多具備較長雙極突起，與放射狀膠質(zhì)細(xì)胞(RGCs)形態(tài)更吻合。BLBP陽性細(xì)胞還能表達(dá)CXCR4及SOX2。
　　3.在胼胝體部位CXCL12治療組與對照組比較，CXCR4/DCX雙標(biāo)陽性細(xì)胞增多，所占面積增加，由鏈狀分布演變?yōu)檩椛錉罘植迹谳椛錉顓^(qū)域之外出現(xiàn)更多散在的CXCR4/DCX雙標(biāo)陽性細(xì)胞;CXCL12+AMD3100治療組與CXCL12治療組比較，這些雙標(biāo)陽性細(xì)胞數(shù)量及所占面積明顯下降且低于對照組，DCX陽性細(xì)胞

13、首尾相連關(guān)系缺失明顯。
　　4.胼胝體部位只有少量的DCX/BLBP雙標(biāo)陽性細(xì)胞，大部分BLBP陽性細(xì)胞緊鄰DCX陽性細(xì)胞;在DCX/BrdU免疫熒光雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)中，部分DCX陽性細(xì)胞同時(shí)也為BrdU陽性細(xì)胞;DCX/GFAP免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果表明，DCX陽性細(xì)胞緊貼GFAP陽性細(xì)胞的內(nèi)側(cè);未觀察到DCX/NeuN雙標(biāo)陽性細(xì)胞。
　　5.在腦損傷區(qū)CXCL12治療組與對照組比較，MMP-2陽性細(xì)胞增多，CXCL12+AMD3100

14、治療組與CXCL12治療組比較，這些陽性細(xì)胞明顯下降且低于對照組。Western Blot以及實(shí)時(shí)PCR結(jié)果與免疫熒光結(jié)果類似，MMP-2蛋白和mRNA的表達(dá)在給予CXCL12后明顯升高，給予CXCL12+AMD3100后則表達(dá)下降且低于對照組。MMP-2/DCX、MMP-2/GFAP、MMP-2/NeuN免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果表明，MMP-2可由DCX陽性細(xì)胞、GFAP陽性細(xì)胞和NeuN陽性神經(jīng)元等細(xì)胞分泌。
　　6.體外神經(jīng)干細(xì)胞分

15、化培養(yǎng)，對照組、CXCL12組和CXCL12+AMD3100組向DCX陽性細(xì)胞的分化比例兩兩比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后，給予CXCL12通過結(jié)合CXCR4能促進(jìn)神經(jīng)前體細(xì)胞增殖，增殖的神經(jīng)前體細(xì)胞為放射狀膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞，其中胼胝體部位增殖的放射狀膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞更具備放射狀膠質(zhì)細(xì)胞雙極突起的形態(tài)學(xué)特征;CXCL12/CXCR4軸還能通過增加損傷區(qū)周圍腦組織中多種細(xì)胞MMP-2的分泌促進(jìn)不成熟神

16、經(jīng)元沿胼胝體遷移，不成熟神經(jīng)元可以來源于放射狀膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的分化，但CXCL12不能增加神經(jīng)干細(xì)胞向不成熟神經(jīng)元分化，不成熟神經(jīng)元在胼胝體的遷移兼具切線遷移和放射狀遷移特點(diǎn)。
　　第三部分CXCL12促進(jìn)大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后血管增生
　　目的:
　　探討CXCL12對大鼠創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)后損傷區(qū)周圍腦組織血管增生的影響及相關(guān)機(jī)制。
　　方法:
　　1.采用顱腦液壓損傷裝置，制備大鼠創(chuàng)傷性腦損傷模型;<

17、br>　　2.將實(shí)驗(yàn)大鼠分成四組:假手術(shù)組只開顱，不制備腦損傷模型，不注射任何試劑;對照組在損傷區(qū)周圍皮質(zhì)注射生理鹽水;CXCL12治療組注射CXCL12，CXCL12+AMD3100治療組注射CXCL12+AMD3100。
　　3.傷后7天，檢測CD31、vWF和VEGF免疫熒光情況，分別以CD31、vWF計(jì)算微血管密度(MVD)，檢測VEGF熒光強(qiáng)度(OD)。
　　4.Western Blot檢測各組VEGF蛋白表達(dá)變化

18、。
　　5.實(shí)時(shí)PCR檢測各組VEGF mRNA表達(dá)變化。
　　結(jié)果:
　　1.CXCL12治療組與對照組比較，MVD(CD31)、MVD(vWF)增高，CXCL12+AMD3100治療組與CXCL12治療組比較MVD(CD31)、MVD(vWF)下降且低于對照組。
　　2.CXCL12治療組與對照組比較，VEGF OD值升高，CXCL12+AMD3100治療組與CXCL12治療組比較下降且低于對照組。