HP-PRRSV疫苗株HuN4-F112感染PAM效率降低的分子機(jī)理的研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的、嚴(yán)重危害生豬養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的重要疫病之一。臨床表現(xiàn)為妊娠母豬流產(chǎn)、死胎和產(chǎn)木乃伊胎，仔豬發(fā)病多表現(xiàn)為呼吸障礙。該病于1987年首次在美國(guó)爆發(fā)，隨后在北美洲及歐洲各國(guó)流行，引起母豬爆發(fā)流產(chǎn)風(fēng)暴。國(guó)內(nèi)于1996年首次分離到PRRSV毒株命名為CH-1a株，2006年下半年開(kāi)始，一種以高熱（超過(guò)41℃）、高發(fā)病率（超過(guò)50％）和高死亡率（高于20％）為主要特征的“無(wú)名高熱

2、癥”在我國(guó)江西省爆發(fā)，并迅速蔓延至全國(guó)28個(gè)省、市和自治區(qū)，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。經(jīng)鑒定該病的病原為PRRSV變異株-高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒(HP-PRRSV)。鑒于該病的嚴(yán)重危害，中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部于2008年將高致病性豬繁殖與呼吸綜合征(HP-PRRS)列為我國(guó)的一類(lèi)動(dòng)物疫病。
　　經(jīng)實(shí)踐證明將PRRSV野毒在Marc-145細(xì)胞系上連續(xù)傳代的方式是制備PRRSV疫苗的有效手段。2010年以來(lái)陸續(xù)有3種HP-PRRS

3、V活疫苗通過(guò)上述方法研制成功，隨著HP-PRRSV弱毒活疫苗在我國(guó)的使用，HP-PRRS得到了有效地防控，了解疫苗的分子致弱機(jī)理對(duì)于PRRS的防控具有指導(dǎo)意義。PRRSV對(duì)巨噬細(xì)胞具有細(xì)胞嗜性，豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAM)被認(rèn)為是PRRSV在宿主內(nèi)復(fù)制的主要靶細(xì)胞，由于PAM是重要的免疫細(xì)胞，具有抗原遞呈作用，因此PRRSV野毒感染宿主的PAM被認(rèn)為是PRRS造成免疫抑制的重要原因。在研究中我們發(fā)現(xiàn)將疫苗株HuN4-F112接種PAM后48

4、h，取上清接種下一代PAM，連續(xù)感染3次，利用RT-RCR方法從最后一代PAM中檢測(cè)不到病毒的核酸，這表明HP-PRRSV活疫苗HuN4-F112株在體外對(duì)PAM的感染與親本毒HP-PRRSV HuN4存在顯著差異，采用同樣的方法對(duì)其他3株P(guān)RRSV弱毒活疫苗(MLV、CH-1R)檢測(cè)均得到了對(duì)PAM的感染能力顯著下降的結(jié)果。由于上述疫苗株均是在Marc-145細(xì)胞中傳代80次以上致弱的，因此我們推斷在傳代過(guò)程中關(guān)鍵基因的突變可能是導(dǎo)致

5、疫苗株對(duì)PAM感染能力的降低的重要原因，確定該關(guān)鍵基因?qū)RRSV致病機(jī)理的研究和PRRS的防控具有重大意義。
　　為鑒定影響PRRSVY疫苗株HuN4-F112影響PAM感染效率的關(guān)鍵基因，本研究以2株感染性克隆cHuN4（以親本株HP-PPRSV HuN4基因組序列構(gòu)建）和cHuN4-F112(以疫苗株HP-PRRSV HuN4-F112)為骨架，利用分子克隆技術(shù)置換相應(yīng)的基因，構(gòu)建了10個(gè)嵌合的感染性克隆質(zhì)粒，最終拯救出10

6、株嵌合病毒。采用熒光定量PCR確定病毒原液中病毒密度，分別以Moi=2.0感染4×106 PAM細(xì)胞，感染24h分別以抗PPRSV的M蛋白的單克隆抗體和FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體染色，最后利用流式細(xì)胞術(shù)評(píng)價(jià)病毒對(duì)PAM的感染效率。通過(guò)逐步的截短替換證明，分別以疫苗株和親本株感染性克隆為骨架分別互換NSP2基因拯救的兩株嵌合病毒感染PAM的效率發(fā)生顯著的改變，其中親本株HuN4的感染效率顯著下降，而疫苗株的感染效率顯著上升，這表明NS

7、P2基因是影響了HP-PRRSV疫苗株HuN4-F112在PAM感染效率的關(guān)鍵基因。
　　為鑒定影響NSP2功能的關(guān)鍵氨基酸，以感染性克隆cHuN-F112和RQNSP2(cHuN-F112為骨架替換cHuN的NSP2基因的嵌合質(zhì)粒)為骨架利用定點(diǎn)突變技術(shù)，分別將NSP2基因上存在差異的氨基酸位點(diǎn)定點(diǎn)突變，構(gòu)建了10株NSP2突變體。通過(guò)PAM感染試驗(yàn)及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，以RQNSP2為骨架將第893位氨基酸由V893突變?yōu)锳8

8、93的病毒和將第979位氨基酸由由S979突變?yōu)镻979的兩株突變體PAM感染效率下降顯著，而以cHuN-F112為骨架同時(shí)將ORF1a上第893位和979位氨基酸同時(shí)突變后，嵌合病毒感染PAM效率顯著提高，這表明ORF1a上第893和979位氨基酸為影響NSP2功能的關(guān)鍵氨基酸。
　　為了探索NSP2基因突變影響疫苗株HuN4-F112對(duì)PAM感染效率的作用機(jī)理，分別將4株互換NSP2或ORF2-7基因的重組病毒及親本毒HuN4

9、和疫苗株HuN4-F112以Moi=5.0感染PAM細(xì)胞。于感染2h、12h、24h、36h和48h分別收集細(xì)胞，細(xì)胞用PBS反復(fù)沖洗離心后去上清提取總RNA，將600 ng RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，最后使用熒光定量PCR檢測(cè)分析。檢測(cè)結(jié)果顯示感染2h檢測(cè)6株病毒均可侵入PAM細(xì)胞且6株病毒拷貝密度不存在明顯的差異，在感染后12～24 h6株病毒基因組RNA均呈現(xiàn)快速?gòu)?fù)制并且其復(fù)制規(guī)律相同，這表明疫苗株NSP2的突變并未影響病毒侵入宿主

10、也未影響病毒基因組RNA的合成。感染36～48 h疫苗株HuN4-F112和嵌合HuN4-F112的NSP2基因的HuN4病毒的RNA合成增長(zhǎng)緩慢并呈下降趨勢(shì)，而親本株HuN4和以cHuN4-F112為骨架替換親本株NSP2基因的嵌合病毒RNA合成量繼續(xù)增加;本實(shí)驗(yàn)室以前的試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，PAM分別被HuN4和HuN4-F112感染后，組裝病毒粒子的蛋白表達(dá)量存在明顯差異:通過(guò)Western blot檢測(cè)顯示當(dāng)被HuN4感染24h時(shí)，PA

11、M細(xì)胞中病毒GP3蛋白的表達(dá)量即接近峰值，且24～48h內(nèi)可持續(xù)檢測(cè)到GP3蛋白的大量表達(dá);但PAM被感染HuN4-F112感染后直至36 h才能檢測(cè)到微量的GP3蛋白的表達(dá)，且直至感染后48 h病毒GP3蛋白的表達(dá)量仍是微量的;當(dāng)兩株病毒互換NSP2蛋白后，結(jié)果發(fā)生了逆轉(zhuǎn)。結(jié)合熒光定量PCR和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的結(jié)果推測(cè)，在PAM中疫苗株HuN4-F112 NSP2基因的突變導(dǎo)致病毒RNA轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)蛋白的功能顯著降低或推遲，進(jìn)而影響病毒

12、粒子的組裝和釋放，最終表現(xiàn)為疫苗感染PAM效率的顯著下降。
　　在體外PAM中接種HP-PRRSV疫苗株HuN4-F112幾乎檢測(cè)不到病毒粒子，但疫苗株免疫仔豬后可監(jiān)測(cè)到3-4周的病毒血癥，這表明在宿主體內(nèi)除PAM外疫苗株還存在其他病毒儲(chǔ)存或復(fù)制的組織。本研究分別以106.0TCID50的疫苗株HuN4-F112感染5頭仔豬，并以3×104.0TCID50的HP-PRRSV HuN4株感染3頭仔豬作為攻毒對(duì)照組，以1頭仔豬做為空白

13、對(duì)照，感染后10d、11d、14d和16d分別將其迫殺，采集心、肝、脾、腎等臟器及頜下淋巴結(jié)、肺門(mén)淋巴結(jié)、腹股溝淋巴結(jié)和PBMC等淋巴器官和扁桃體、胸腺等免疫器官。將上述組織研磨后取活細(xì)胞，采用流式細(xì)胞術(shù)評(píng)價(jià)各組織細(xì)胞被感染比例。結(jié)果顯示疫苗免疫組仔豬在感染后10～16d體內(nèi)仍存在病毒血癥，但其外周血淋巴細(xì)胞(PBMC)被感染率幾乎為零，其PAM感染率較低，主要儲(chǔ)存器官為扁桃體，感染率最高可達(dá)11.5％，其感染比例有隨感染時(shí)間推移增高的

14、趨勢(shì);此外在各個(gè)淋巴結(jié)細(xì)胞中也檢測(cè)到了病毒感染;各臟器組織中心臟和脾臟細(xì)胞被感染的比例最高，肝細(xì)胞和腎細(xì)胞感染比例不顯著;重要的免疫器官胸腺中未被感染。攻毒對(duì)照組中，PAM被感染率比疫苗組高，但最高的感染比例也僅為5.3％，這可能與大部分感染的PAM細(xì)胞已經(jīng)破碎有關(guān)。感染率最高的組織為扁桃體，其細(xì)胞被感染率分別為14.1％、16.6％和30.7％，此外其淋巴結(jié)細(xì)胞和脾細(xì)胞可被顯著感染，被感染比例比疫苗組高，PBMC也幾乎未被感染這與疫苗

15、免疫組的結(jié)果相同。據(jù)此推測(cè)疫苗株HuN4-F112由于感染PAM和胸腺細(xì)胞效率的下降導(dǎo)致在體內(nèi)疫苗毒力的降低，但其仍能在扁桃體中復(fù)制，從而能刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，發(fā)揮免疫保護(hù)作用。
　　本研究確定了影響PRRSV疫苗株HuN4-F112在PAM上復(fù)制效率的關(guān)鍵基因，可能部分揭示了該疫苗株致弱的分子機(jī)理，對(duì)PRRSV的基礎(chǔ)研究及下一代疫苗的開(kāi)發(fā)具有重要的意義;此外本研究還確定了PRRSV儲(chǔ)存和復(fù)制的主要場(chǎng)所扁桃體，對(duì)研究PRRSV持