暗黑鰓金龜中腸Cry8Ea3特異性結(jié)合蛋白的鑒定及結(jié)合特性研究.pdf

1、暗黑鰓金龜（Holotrichia parallela）屬于鞘翅目，鰓金龜科，其幼蟲(chóng)是國(guó)內(nèi)外難防的地下害蟲(chóng)之一。對(duì)花生、馬鈴薯和甘薯等農(nóng)作物為害嚴(yán)重，致使農(nóng)作物產(chǎn)量大幅度減少，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。蘇云金桿菌（簡(jiǎn)稱(chēng)Bt）殺蟲(chóng)晶體蛋白Cry8類(lèi)對(duì)鞘翅目害蟲(chóng)有特異殺蟲(chóng)活性，其中Cry8Ea對(duì)暗黑鰓金龜有較好的殺蟲(chóng)活性。研究Cry8Ea蛋白中腸結(jié)合蛋白，為Cry8Ea蛋白的作用機(jī)理提供依據(jù)，為新型生物殺蟲(chóng)劑的研發(fā)和轉(zhuǎn)基因作物的培育提供理論依據(jù)。

2、
　　本研究從河北省保定市3個(gè)區(qū)縣采集土壤樣品，篩選出一株對(duì)暗黑鰓金龜高效活性的Bt菌株，命名Bt-GWL。鏡檢發(fā)現(xiàn)該菌株的伴孢晶體形態(tài)有小圓球型、大圓球型和橢球型。Bt-GWL菌株含有cry1、cry5、cry8、cry9和cry26-28類(lèi)基因型，SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)Bt-GWL菌株含有分子量為130、116、99、80和55kDa的蛋白。
　　從該菌株中分離鑒定了cry8基因（GenBank登錄號(hào):KC855216

3、），經(jīng)國(guó)際Bt命名委員會(huì)正式命名為cry8Ea3。該基因的開(kāi)放閱讀框大小為3495bp，編碼1164個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白分子量為130kDa，等電點(diǎn)為4.68。構(gòu)建了工程菌株HD8Ea3，成功表達(dá)130kDa的蛋白。Cry8Ea3蛋白對(duì)暗黑鰓金龜一齡12d幼蟲(chóng)生物活性測(cè)定的LC50為103.75μg/g。利用胰蛋白酶消化Cry8Ea3原毒素蛋白，并利用superdex200分子篩層析純化，獲得60kDa的活化片段。
　　利用Liga

4、nd blot和免疫熒光定位實(shí)驗(yàn)對(duì)Bt Cry8Ea3蛋白在暗黑鰓金龜幼蟲(chóng)中腸的結(jié)合蛋白APN進(jìn)行了研究。克隆并表達(dá)了hpapn-psg、hpapn-pse和hpapng、hpapne結(jié)構(gòu)域基因。結(jié)果顯示，GluZincin和ERAP均能與Cry8Ea3活性片段發(fā)生結(jié)合?？寺～@得暗黑鰓金龜幼蟲(chóng)中腸hpapn-ps和hpapn基因。hpapn-ps基因大小為2304bp（GenBank登錄號(hào):KU497558），編碼767個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋

5、白分子量為87.3kDa，等電點(diǎn)為5.49，具有APN蛋白的保守序列170GAMEN174和206HEX2H210X18E229，一個(gè)O-糖基化位點(diǎn):T363。hpapn開(kāi)放閱讀框大小為3069bp（GenBank登錄號(hào):KU509050），編碼1021個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白分子量為115.6kDa，等電點(diǎn)為3.98，具有APN蛋白的保守序列303GAMEN307和339HEX2H343X18E362，含有18個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，GPI錨定位

6、點(diǎn)位于C-端G1000，26個(gè)O-糖基化位點(diǎn)，2個(gè)N-糖基化位點(diǎn)N279、N684。
　　qRT-PCR鑒定hpapn-ps和hpapn基因在暗黑鰓金龜不同組織表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)hpapn-ps和hpapn基因在中腸上的表達(dá)量都較高，在其他組織表達(dá)量較低。構(gòu)建了hpapn-ps、hpapn及其結(jié)構(gòu)域基因重組Bacmid，轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞Sf9，Western blot驗(yàn)證其在Sf9中成功表達(dá)，免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示細(xì)胞表達(dá)的APN蛋白及其結(jié)構(gòu)

7、域與Cry8Ea3蛋白在激發(fā)光下發(fā)出綠色熒光，說(shuō)明HpAPN-PS和HpAPN能與Cry8Ea3蛋白特異性結(jié)合，推斷它們?yōu)楣δ苄允荏w蛋白。
　　結(jié)合暗黑鰓金龜幼蟲(chóng)中腸轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，利用RACE-PCR方法克隆了hpalp全長(zhǎng)基因。該基因開(kāi)放閱讀框大小為1605bp（GenBank登錄號(hào):KY922835），編碼534個(gè)氨基酸序列，預(yù)測(cè)蛋白分子量為59kDa，等電點(diǎn)為5.18，具有21個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，GPI錨定位點(diǎn)位于C-端D5

8、14，2個(gè)N-糖基化位點(diǎn)N100和N296。分別構(gòu)建原核重組表達(dá)載體和重組Bacmid-hpalp，均成功表達(dá)分子量為59kDa ALP蛋白。qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)hpalp基因在中腸上的表達(dá)最高，在其他組織表達(dá)較低，前腸上的表達(dá)量最低。Ligand blot分析結(jié)果顯示，HpALP蛋白能夠與Cry8Ea3活性片段特異結(jié)合。
　　分離鑒定了一種新的Cry8Ea3結(jié)合蛋白Ⅴ-ATPase A亞基。利用RACE-PCR技術(shù)獲得了該基因

9、的全長(zhǎng)。hpvaa基因的開(kāi)放閱讀框?yàn)?845bp(GenBank登錄號(hào):KU497557)編碼614個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白分子量為67.85kDa，等電點(diǎn)為4.9，HpVAA具有ATP-synt_ab_N和ATP-synt_ab_C結(jié)構(gòu)域，保守位點(diǎn)Walker A(GAFGCGKT)和Walker B(SMMAD)。Ligand blot分析結(jié)果顯示，HpVAA蛋白能夠與Cry8Ea3活性片段特異結(jié)合。qRT-PCR鑒定hpvaa基因在暗黑