Cry9Ea10突變體的構建及與美國白蛾中腸結合蛋白的結合特征研究.pdf

1、蘇云金桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）Cry9Ea蛋白對入侵生物美國白蛾(Hyphantria cunea)具有較好的殺蟲活性。為了確定Cry9Ea蛋白與美國白蛾中腸結合蛋白相互作用中的關鍵區(qū)域和位點，本研究首次通過生物信息學分析選擇Cry9Ea10DomainⅢβ20-β21loop上的7個氨基酸殘基位點進行丙氨酸掃描突變，獲得了殺蟲活性和親和力都發(fā)生變化的突變體，第一次克隆得到美國白蛾中腸類鈣黏蛋白基因，為

2、進一步深入研究Cry9類蛋白殺蟲作用機理以及探索美國白蛾中腸受體功能提供了依據(jù)。
　　本研究從呈現(xiàn)細菌感染癥狀死亡的美國白蛾幼蟲體內分離克隆得到了新的cry9Ea基因，國際Bt命名委員會正式命名為cry9Ea10，構建了重組穿梭表達載體pSXY422b-9Ea10，電擊轉化Bt無晶體突變株HD73-，獲得工程菌HD（9Ea10），高效表達130kDa的Cry9Ea10蛋白，對美國白蛾幼蟲殺蟲活性LC50為8.02μg/mL。同時在

3、大腸桿菌BL21(DE3)中表達了Cry9Ea10DomainⅠ、DomainⅡ和DomainⅢ三個結構域蛋白。利用在線分析工具和服務器對Cry蛋白的一級結構和二級結構進行分析并建立了蛋白質三維結構預測模型，分析發(fā)現(xiàn)DomainⅢ上熱點殘基較為聚集，對比其它Cry9類蛋白結構，Cry9Ea10DomainⅢ上的β20-β21loop呈現(xiàn)明顯差異。對β20-β21loop上的氨基酸殘基進行丙氨酸掃描突變，獲得N601A、G602A、S60

4、3A、L604A、T605A、Y606A和E607A共7個突變子，均能產生130kDa的小球形晶體蛋白。
　　利用RACE-PCR方法獲得了美國白蛾中腸類鈣黏蛋白全長基因hccad-like（hccadherin-like），在HighFive細胞中表達約200kDa的HcCAD-like蛋白。同時對HcCAD-like蛋白N端Cadherin repeats CR1-CR5和近膜區(qū)Cadherin repeats CR6-MPR

5、功能域進行了體外表達，Ligand Blot分析結果顯示，Cry9Ea10蛋白能夠與HcCAD-like特異結合，并且與CR6-MPR結合力較強，生物測定結果表明CR6-MPR可以增加Cry9Ea10蛋白對美國白蛾幼蟲的殺蟲活性?？寺〔⒈磉_了美國白蛾中腸氨肽酶N4基因hcapn4及其小片段基因hcapn-mv，Ligand Blot分析結果顯示，Cry9Ea10蛋白與HcAPN4特異結合并且結合區(qū)域位于GluZincin結構域上的HcA

6、PN-MV。Cry9Ea10三個結構域蛋白與中腸結合蛋白功能域的體外結合實驗表明DomainⅢ在與所有功能域結合中都起到重要作用。
　　對美國白蛾初孵幼蟲進行生物活性測定，結果顯示N601A(LC50為15.84μg/mL)和G602A（LC50為14.41μg/mL）的殺蟲活性與野生型(LC50為9.40μg/mL)相比分別降低了69％和53％;S603A和T605A活性無明顯變化;L604A(LC50為3.73μg/mL)、Y

7、606A(LC50為2.87μg/mL)和E607A(LC50為2.12μg/mL)的殺蟲活性則分別提高了2.52、3.28和4.44倍。
　　7個突變子蛋白與美國白蛾中腸結合蛋白的親和能力分析結果顯示，N601A、G602A和S603A與HcCAD-like、CR1-CR5和CR6-MPR的親和力顯著降低;L604A與HcAPN4及其N端結構域GluZincin的親和力顯著升高;Y606A與HcAPN4的結合力顯著升高;E607