Ku80分子對人肝癌細胞增殖的影響及其機制的研究.pdf

1、第一部分研究Ku80分子表達對SMMC7721肝癌細胞增殖的影響
　　實驗目的：探討Ku80分子表達對SMMC7721肝癌細胞增殖的影響。
　　實驗方法：
　　1.從國外交流獲得pcDNA3.1-myc-his和pcDNA3.1-myc-his-Ku80真核表達質粒；將質粒轉化到DH5α感受態(tài)細菌中，培養(yǎng)擴增細菌；小量提取質粒鑒定無誤后，繼續(xù)擴增細菌，大量提取并純化質粒，最后測序鑒定。
　　2.將pcDNA3.1

2、-myc-his和pcDNA3.1-myc-his-Ku80真核表達質粒轉染到不表達Ku80的SMMC7721肝癌細胞中，通過G418篩選獲得穩(wěn)定表達Ku80的細胞克隆，western blot鑒定Ku80蛋白表達陽性的SMMC7721細胞克隆。
　　3.直接細胞計數和軟瓊脂克隆形成實驗檢測高表達Ku80的SMMC7721肝癌細胞克隆與對照細胞株的體外增殖能力。
　　4.將高表達Ku80的SMMC7721肝癌細胞克隆和對照細

3、胞株分別接種到裸鼠皮下，研究接種各組細胞形成皮下腫瘤的生長情況和裸鼠的生存時間。實驗結果：
　　1.經鑒定成功獲得可供細胞轉染用的pcDNA3.1-myc-his和pcDNA3.1-myc-his-Ku80真核表達質粒。
　　2. Western blot檢測證實成功篩選獲得穩(wěn)定高表達Ku80蛋白的細胞克隆3個：Ku80-18，Ku80-26和Ku80-33，及轉染空質粒的對照組細胞克?。╒ector）。
　　3.直接

4、細胞計數顯示，Ku80-18克隆細胞(1.715±0.242，×104)和Ku80-26克隆細胞(1.595±0.303，×104)在生長至第5天的細胞數目與對照組Vector細胞(4.408±1.486，×104)或SMMC7721細胞(5.592±0.906，×104)相比明顯減低（p<0.01）；Ku80-18克隆細胞(2.223±0.481，×104)和Ku80-26克隆細胞(2.025±0.075，×104)在生長第7天的細胞

5、數目與對照組Vector細胞(6.733±0.651，×104)或SMMC7721細胞(7.03±0.219，×104)相比明顯減低（p<0.01）。軟瓊脂克隆形成實驗顯示，Ku80-18克隆細胞(53±7個)和Ku80-26克隆細胞(50±7個)在軟瓊脂中形成細胞克隆的數目與對照組Vector細胞(109±6個)或SMMC7721細胞(117±9個)相比明顯減低（p<0.01）。
　　4.裸鼠皮下移植瘤生長至44天，繪制其生長曲

6、線發(fā)現，Ku80-18和Ku80-26克隆細胞形成的皮下瘤生長速度在24天后明顯低于Vector或SMMC7721細胞（p<0.01）；第44天，Ku80-18克隆細胞(1.66±0.39cm3)和Ku80-26克隆細胞(1.50±0.31cm3)形成皮下瘤的平均體積與對照組Vector細胞(3.19±0.39 cm3)或細胞SMMC7721(3.04±0.51cm3)相比明顯減低（p<0.01）；Ku80-18克隆細胞(0.1425±

7、0.0712g)和Ku80-26克隆細胞(0.1300±0.0404g)形成皮下瘤的平均重量與對照組Vector細胞(0.5497±0.1273g)或SMMC7721細胞(0.6071±0.1729g)相比明顯減低（p<0.01）。Vector細胞接種的裸鼠中位生存時間為52.0±1.1天，Ku80-18細胞接種的裸鼠中位生存時間為69.0±2.2天；Ku80-18組裸鼠與Vector組裸鼠相比中位生存時間延長率為32.8％；Vecto

8、r和Ku80-18細胞接種裸鼠的中位生存時間的差異具有顯著的統(tǒng)計學意義（p<0.01）。
　　第二部分研究Ku80分子表達對SMMC7721肝癌細胞增殖影響的分子機制
　　實驗目的：研究Ku80表達對SMMC7721肝癌細胞增殖影響的可能分子機制。
　　實驗方法：
　　1.流式細胞術檢測高表達Ku80的SMMC7721細胞克隆和對照細胞株的細胞周期分布。
　　2.流式細胞術檢測高表達Ku80的SMMC772

9、1細胞克隆和對照細胞株的凋亡水平。
　　3. Western blot檢測高表達Ku80的SMMC7721細胞克隆和對照細胞株細胞周期相關蛋白的表達水平。
　　4. Western blot檢測高表達Ku80的SMMC7721細胞克隆和對照細胞株凋亡相關蛋白的表達水平。
　　5.免疫組織化學檢測接種各組細胞形成的裸鼠皮下瘤組織中細胞周期蛋白的表達水平；TUNEL法檢測接種各組細胞形成的裸鼠皮下瘤組織中細胞凋亡水平。

10、r>　　6.將靶向干擾p53和p21表達的三個siRNAs分別命名為sip53-1，sip53-2，sip53-3和sip21-1，sip21-2，sip21-3.按照說明書步驟，使用Lipofectamine2000將這些siRNAs轉染到Vector和Ku80-18細胞中；Western blot檢測干擾效果；將干擾后的各組細胞置于37℃5％CO2環(huán)境中培養(yǎng)，在不同的時間點收集細胞，檢測各組細胞增殖能力和細胞周期分布（方法同前）。<

11、br>　　實驗結果：
　　1.流式細胞術檢測細胞周期分布顯示，經過10％胎牛血清刺激0,12,24,36和48小時后，Vector細胞的S期比率分別為37.10±3.83％、34.56±3.32％、34.89±4.24％,、39.8±5.48％和29.72±6.50％，Ku80-18細胞的S期比率分別為53.70±4.77％、71.88±4.46％、74.14±3.70％、85.46±4.08％和77.84±4.15％，兩組細胞在

12、各個時間點的S期比率差異都具有明顯的統(tǒng)計學意義（p<0.01）。
　　2.流式細胞術檢測細胞凋亡顯示，SMMC7721細胞的凋亡比率是
　　1.81±0.15％,Vector細胞的凋亡比率是1.83±0.25％，Ku80-18克隆細胞的凋亡比率是9.44±1.52％，Ku80-26克隆細胞的凋亡比率是9.26±1.72％；Ku80-18克隆細胞和Ku80-26克隆細胞的凋亡比率與SMMC7721細胞或Vector細胞的凋亡比

13、率相比差異具有顯著的統(tǒng)計學意義（p<0.01），而SMMC7721細胞與Vector細胞的凋亡比率相比差異無顯著的統(tǒng)計學意義（p>0.05），Ku80-18細胞克隆與與Ku80-26細胞克隆的凋亡比率相比差異也無顯著的統(tǒng)計學意義（p>0.05）。
　　3. Western blot檢測發(fā)現，Ku80-18和Ku80-26細胞克隆中p53和p21蛋白的表
　　達水平與對照組細胞SMMC7721或Vector相比明顯增高，cyc

14、linA和cdk2蛋白的表達水平減低，cylinE蛋白表達水平無明顯差異。
　　4. Western blot檢測發(fā)現，Ku80-18和Ku80-26細胞克隆中cleaved PARP，caspase-3和caspase-8表達水平與對照組細胞SMMC7721或Vector相比明顯增高，Bcl-2表達水平減低，而Bax表達水平無明顯變化。
　　5.免疫組織化學檢測發(fā)現Ku80-18細胞接種的裸鼠皮下瘤組織與Vector細胞接

15、種的裸鼠皮下瘤組織相比，p53和p21蛋白的陽性表達率明顯增高（p<0.01），cyclinA和cdk2蛋白的陽性表達率明顯降低(p<0.01)，cyclinE蛋白陽性表達率的差異無顯著統(tǒng)計學意義（p>0.05）。TUNEL法檢測裸鼠皮下瘤組織的細胞凋亡水平發(fā)現，SMMC7721組的凋亡率是3.5±1.0％，Vector組的凋亡率是3.6±1.1％，Ku80-18組的凋亡率是9.3±2.0％，Ku80-26組的凋亡率是10.0±2.1％

16、；Ku80-18組和Ku80-26組的凋亡率與SMMC7721組或Vector組相比差異具有顯著的統(tǒng)計學意義（p<0.01），SMMC7721組的凋亡率與Vector組相比差異無顯著的統(tǒng)計學意義（p>0.05），Ku80-18組凋亡率與Ku80-26組相比差異無顯著的統(tǒng)計學意義（p>0.05）。
　　6.細胞周期檢測顯示，Ku80-18細胞在轉染sip53-3或sip21-172小時后S期的比率與Vector細胞相比差異無顯著的統(tǒng)

17、計學意義（p>0.05）。此外，Vector細胞在轉染mock，sip53-3或sip21-1后各個時間點的S期比率差異無顯著的統(tǒng)計學意義（p>0.05）。細胞增殖實驗進一步發(fā)現，Ku80-18細胞在敲減p53或p21分子表達第5天后的細胞數目與轉染mock的Ku80-18細胞相比差異具有顯著的統(tǒng)計學意義（p<0.01）。與轉染mock的Ku80-18細胞相比，Ku80-18細胞在轉染sip53-3或sip21-1后生長至第5天細胞數目

18、平均增加253％或245％。轉染mock，sip21-1和sip53-3的Vector三組細胞在各個時間點比較，細胞數目在各組間差異均無顯著的統(tǒng)計學意義（p>0.05）。
　　統(tǒng)計學分析
　　所有實驗結果皆重復三次，以上所有數據均以均數±標準差形式表示，并應用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，各組組間差異采用單因素方差分析(ANOVA)，分類變量的比較采用卡方檢驗或Fisher精確檢驗，采用Kaplan Meier法進行生

19、存分析，若p<0.05則認為差異具有顯著的統(tǒng)計學意義。
　　結論
　　1.在體外增殖實驗和體內裸鼠成瘤實驗中，高表達Ku80蛋白可明顯抑制SMMC7721細胞株的增殖能力。
　　2. Ku80高表達可引起SMMC7721肝癌細胞阻滯在S期，并伴隨著細胞凋亡增加。
　　3. Ku80高表達可上調p53和p21蛋白表達水平。
　　4. Ku80抑制肝癌細胞增殖和引起細胞周期S期阻滯的分子機制依賴于p53-p21