紫蘇4-羥苯基丙酮酸雙加氧酶基因的克隆及分析.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)以唇形科植物紫蘇(Perilla frutescens)為研究對(duì)象，首次從紫蘇中克隆得到了迷迭香酸合成途徑中的旁路基因4-羥苯基丙酮酸雙加氧酶(4-HydroxyphenlpyruvateDioxygenase，HPPD)基因的cDNA和基因組DNA序列全長以及啟動(dòng)子序列，全長cDNA命名為PerHPPD（GenBank登錄號(hào):KC762747.1），并對(duì)該基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析和基因表達(dá)分析，為深入研究迷迭香酸的次生代謝機(jī)制和

2、改善紫蘇的種質(zhì)資源提供了有力的理論基礎(chǔ)和實(shí)踐依據(jù)。
　　通過已報(bào)道的唇形科植物彩葉草和丹參的HPPD基因序列比對(duì)，在保守序列區(qū)域設(shè)計(jì)簡并引物，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增得到HPPD基因的部分序列片段，然后再利用cDNA末端快速擴(kuò)增（Rapid amplification of cDNA ends，RACE）技術(shù)克隆得到1636bp的cDNA全長，其中包含1434bp的開放閱讀框(ORF)，編碼477個(gè)氨基酸殘基，含有長度為22bp的5’非

3、編碼區(qū)(5'UTR)和180bp的3’非編碼區(qū)(3'UTR)。并設(shè)計(jì)全長引物克隆得到該cDNA序列對(duì)應(yīng)的DNA序列全長2876bp，包含兩個(gè)外顯子，一個(gè)內(nèi)含子。外顯子在序列中的位置為1-1248bp和2610-2876bp，內(nèi)含子的位置為1249-2609bp。
　　經(jīng)BLAST基因比對(duì)，得到的PerHPPD基因的cDNA全長序列與其它物種中報(bào)道的HPPD基因具有很高的相似性，與丹參（Salvia miltiorrhiza）和彩葉

4、草（Solenoatemon scutellarioides）核苷酸的一致性為81.22％和85.93％，編碼的氨基酸的一致性為70.98％和75.62％。利用生物信息學(xué)軟件對(duì)克隆得到的紫蘇PerHPPD基因進(jìn)行分析，結(jié)果表明:其編碼的氨基酸表現(xiàn)為親水性，是一個(gè)親水蛋白;不具有跨膜結(jié)構(gòu)域。紫蘇HPPD蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示其含有21.59％的α螺旋，21.17％的延伸鏈，8.39％的β折疊，48.85％的無規(guī)則卷曲。對(duì)其高級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測

5、，得到了紫蘇HPPD蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型。HPPD系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明HPPD基因有明顯的種屬特性，且紫蘇HPPD基因與唇形科植物HPPD基因親緣關(guān)系最近。
　　采用基因組步移方法，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到了長度為1953bp的紫蘇HPPD基因5’側(cè)翼序列（啟動(dòng)子區(qū)域），并對(duì)啟動(dòng)子序列的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和順式作用元件進(jìn)行分析，結(jié)果顯示紫蘇HPPD基因啟動(dòng)子調(diào)控區(qū)域有多個(gè)與植物脅迫和生長相關(guān)的順式作用元件，如脫落酸應(yīng)答順式作用元件、茉莉酸甲酯調(diào)控順