甲型流感病毒感染A549細(xì)胞的表達(dá)譜分析及相關(guān)基因功能研究.pdf

1、流感病毒是造成人類呼吸道感染的重要病原之一，流感病毒不同亞型和不同毒株不斷發(fā)生抗原漂移和抗原轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致針對(duì)流感病毒蛋白設(shè)計(jì)的藥物由于病毒的變異迅速產(chǎn)生耐藥。從宿主角度闡明病毒與宿主之間的相互作用機(jī)制，尤其是闡明抑制或促進(jìn)病毒復(fù)制的宿主基因編碼產(chǎn)物無疑將為抗病毒研究提供新的策略和靶點(diǎn)，目前已經(jīng)成為病毒學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。鑒于此，本研究擬利用表達(dá)譜，全面分析流感病毒感染不同時(shí)間段的宿主細(xì)胞的基因組的表達(dá)變化，據(jù)此分析這些表達(dá)發(fā)生變化的基因?qū)α?/p>

2、感病毒復(fù)制的調(diào)控作用，從而為從宿主細(xì)胞基因中尋找與流感病毒復(fù)制相關(guān)的基因奠定基礎(chǔ)。
　　 本論文首先研究了甲型流感病毒代表株A/H1N1/PR/8/34在人肺癌細(xì)胞A549上的復(fù)制特性。利用免疫熒光的方法檢測(cè)不同感染復(fù)數(shù)(MOI)在不同時(shí)間點(diǎn)的流感病毒復(fù)制情況，結(jié)果顯示隨著病毒感染量的增加，綠色熒光顯著增加，隨著時(shí)間的增多，在感染12h(h)的時(shí)候，可以明顯觀察到流感病毒的復(fù)制。MOI=1時(shí)，流感病毒在A549上的復(fù)制隨時(shí)間的增

3、多而增多，在24h時(shí)，80％左右的細(xì)胞被感染，因此后續(xù)研究均選用1MOI流感病毒感染A549細(xì)胞。然后利用1MOI的流感病毒感染A549細(xì)胞，在感染后4h、12h、24h及48h，分別提取細(xì)胞總RNA進(jìn)行表達(dá)譜分析。表達(dá)譜結(jié)果顯示，流感病毒感染4h時(shí)，只有兩個(gè)基因PRO1073、組蛋白去乙?；傅谋磉_(dá)發(fā)生了明顯的變化；感染12h時(shí)，有45個(gè)基因表達(dá)發(fā)生上調(diào)，沒有發(fā)現(xiàn)下調(diào)的基因，在這45個(gè)基因中，有10個(gè)是干擾素及干擾素誘導(dǎo)表達(dá)的基因；感

4、染24h時(shí)，表達(dá)發(fā)生變化的基因有298個(gè)，其中表達(dá)上調(diào)的282個(gè)，下調(diào)的16個(gè)，此時(shí)干擾素上游、干擾素本身及干擾素下游調(diào)控基因均發(fā)生了明顯變化，其中流感病毒的已知的模式識(shí)別受體TLR3和RIG-I表達(dá)顯著上調(diào)；感染48h時(shí)，共有265個(gè)基因表達(dá)發(fā)生變化，其中上調(diào)的有216個(gè)，下調(diào)的有49個(gè)。通過熒光定量PCR對(duì)流感病毒感染細(xì)胞后表達(dá)發(fā)生上調(diào)及下調(diào)的18個(gè)基因進(jìn)行驗(yàn)證后，發(fā)現(xiàn)上調(diào)的基因與表達(dá)譜結(jié)果一致，下調(diào)的基因也與表達(dá)譜結(jié)果基本一致。然

5、后我們對(duì)表達(dá)譜中上調(diào)及下調(diào)的基因進(jìn)行信號(hào)通路分析發(fā)現(xiàn)：表達(dá)譜中發(fā)生上調(diào)的基因大部分與干擾素相關(guān)，屬于干擾素上游信號(hào)通路如MAPK通路、NF-kB通路，或者是干擾素通路本身及其誘導(dǎo)基因，而部分下調(diào)基因與糖代謝或者脂代謝相關(guān)。我們后續(xù)的研究將針對(duì)表達(dá)譜中的表達(dá)發(fā)生下調(diào)的基因進(jìn)行，擬將這些基因的表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行過表達(dá)后觀察對(duì)流感病毒復(fù)制的影響。
　　 為了便于大規(guī)模篩選與流感病毒復(fù)制相關(guān)的基因，我們建立了高通量的檢測(cè)流感病毒復(fù)制的細(xì)胞內(nèi)免

6、疫印跡法(In-CellWestern)。為了評(píng)價(jià)In-CellWestern方法，將不同MOI的流感病毒感染細(xì)胞后，與經(jīng)典的半數(shù)組織病變法(TCID50)的方法進(jìn)行比較，結(jié)果顯示In-CellWestern最低可檢測(cè)0.01MOI的病毒感染，且與TCID50的測(cè)定結(jié)果具有較好的一致性。In-CellWestern適用于高通量檢測(cè)，具有簡(jiǎn)便、靈敏的特點(diǎn)。
　　 為了分析表達(dá)譜中表達(dá)發(fā)生下調(diào)基因?qū)α鞲胁《緩?fù)制是否具有調(diào)控作用，我們

7、將表達(dá)譜中表達(dá)發(fā)生下調(diào)的基因中的34個(gè)基因進(jìn)行過表達(dá)，24h后，感染1MOI流感病毒。24h后通過In-CellWestern方法對(duì)病毒復(fù)制情況進(jìn)行檢查，然后挑選其中的14個(gè)有變化的基因進(jìn)行驗(yàn)證，確定8個(gè)基因?qū)α鞲胁《緩?fù)制具有抑制作用。最后選擇APOH和SULF2基因進(jìn)行劑量依賴關(guān)系分析，選擇不同的量轉(zhuǎn)染后，觀察對(duì)流感病毒復(fù)制的抑制作用。24h后，以1MOI的流感病毒對(duì)細(xì)胞進(jìn)行感染，用In-CellWestern進(jìn)一步驗(yàn)證這兩個(gè)基因?qū)α?/p>

8、感病毒的調(diào)控作用。在確定了這兩個(gè)基因?qū)α鞲胁《镜膹?fù)制與轉(zhuǎn)染的量具有劑量依賴關(guān)系后，我們接著采用同樣的方法處理細(xì)胞，利用熒光定量PCR的方法對(duì)流感病毒8個(gè)基因片段(PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M及NS)的vRNA、cRNA及mRNA的表達(dá)變化進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，APOH及SULF2對(duì)流感病毒八片段的vRNA、cRNA及mRNA均有抑制作用。
　　 綜上所述，本研究利用基因芯片技術(shù)檢測(cè)了甲型流感病毒感染A549細(xì)胞后基因