PI3K-Akt-FoxO3a通路在文拉法辛保護皮質酮誘導PC12細胞損傷中的作用.pdf

1、研究背景：抑郁癥(depression)是由各種原因引起的以抑郁為主要癥狀的一組心境障礙(mood disorders)或情感性障礙(affective disorders)，是臨床最常見的精神疾患之一，其發(fā)病率僅次于精神分裂癥，該病是一種情感性精神障礙，臨床表現(xiàn)以顯著而持久的心境低落為主，并有相應的思維和行為改變。如思維遲緩，言語動作減少等，并伴隨有食欲降低、性欲減退、睡眠障礙等軀體癥狀。后果更為嚴重時約有15％的抑郁癥患者有自殺傾向

2、，抑郁癥正在成為威脅人類健康的嚴重疾患。據(jù)世界衛(wèi)生組織的最新資料顯示，到了2020年，抑郁癥將成為僅次于癌癥的人類第二大殺手，而對于中國來說，抑郁癥將成為中國疾病負擔最重的第二大疾病。自傷、自殘、自殺及擴大性自殺者中，75％～85％為患有抑郁癥患者所為?？梢哉f，目前抑郁癥已成為中國三大公共衛(wèi)生健康問題之一。對抑郁癥機制的研究中抑郁癥發(fā)病的單胺假說是目前為大多數(shù)人接受的一種理論，單胺假說的發(fā)現(xiàn)是最初是從藥理學的研究中得到啟示的。能提高中樞

3、神經(jīng)系統(tǒng)單胺類神經(jīng)遞質功能或提高它們在神經(jīng)突觸問隙的濃度的藥物都有改善情緒治療抑郁癥狀的作用。因此，專家認為，抑郁癥的發(fā)生與突觸內神經(jīng)遞質水平的降低有直接關系；但是隨著更多臨床研究發(fā)現(xiàn)，單胺學說不能解釋抗抑郁藥能在給藥數(shù)小時后增加神經(jīng)遞質在突觸間隙的濃度，但抗抑郁的療效卻在連續(xù)治療2-4周才開始出現(xiàn)的現(xiàn)象。單胺假說已不足以解釋臨床研究中的疑問，因此，人們提出了其他一些假說。
　　 慢性抑郁癥患者的MRI(Magnetic Res

4、onance Imaging，磁共振成像，MRI)結果發(fā)現(xiàn)某些大腦區(qū)域傾向于比正常人的相應區(qū)域?。粍游飳嶒炓脖砻骺挂钟羲幠軌虮Ｗo由于應激造成的海馬體積縮小，海馬體積的縮小極有可能是由于海馬神經(jīng)元的萎縮，研究發(fā)現(xiàn)，應激過程中糖皮質激素水平的升高是海馬神經(jīng)元損傷的主要原因，應激導致的HPA軸(hypothalamic-pituitary-adrenal axis，下丘腦-垂體-腎上腺軸)紊使體內皮質醇水平的增加，導致海馬神經(jīng)元功能障礙和結構

5、改變，甚至發(fā)生神經(jīng)元變性和死亡，如抑郁癥發(fā)生后興奮性氨基酸谷氨酸堆積，導致神經(jīng)元變性，引起海馬神經(jīng)元的凋亡和死亡，甚至出現(xiàn)大腦功能形態(tài)損害。而抗抑郁藥很可能是通過增加生長和存活促進因子如BDNF(Brain-derived neurotrophic factor，腦源性神經(jīng)生長因子)的表達而阻止或逆轉海馬神經(jīng)元的萎縮和損傷來實現(xiàn)其治療作用。研究發(fā)現(xiàn)抗抑郁藥的慢性治療可上調BDNF及其受體trkB(Tropomyosin-related

6、receptor B，原肌球蛋白相關受體B)的表達從而加強海馬神經(jīng)元生成，促進神經(jīng)元分枝并阻止萎縮。因此，抗抑郁藥極有可能使通過保護神經(jīng)元損傷，改善抑郁癥患者腦區(qū)器質性病變，從而達到抗抑郁作用。因此，本課題主要從抗抑郁藥的神經(jīng)保護作用出發(fā)，探討抗抑郁藥可能的作用機制。
　　 研究發(fā)現(xiàn)抗抑郁藥能夠通過cAMP(cyclic adenosine monophosphate，環(huán)磷酸腺苷通路)、PI(phosphatidylinosit

7、ol，磷脂酰肌醇)信號轉導系統(tǒng)以及各種生化物質影響PI3K/Akt(Phosphatidylinositol-3-kinase/Protein kinase B 磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B)通路，而FoxO(Forkhead box,sub-group“O”，F(xiàn)oxO轉錄因子)作為PI3K/Akt通路的下游轉錄因子，在調節(jié)細胞周期，增殖，存活以及氧化應激等方面起著重要的作用，因此，本課題以皮質酮誘導PC12細胞損傷模擬抑郁癥細胞模型，

8、觀察抗抑郁藥文拉法辛對抗由皮質酮誘導PC12細胞損傷的保護作用及PI3K/Akt/FoxO3a通路是否參與了文拉法辛的保護作用。
　　 研究目的：
　　 1、觀察文拉法辛對皮質酮誘導的PC12細胞損傷的保護作用。
　　 2、觀察文拉法辛保護皮質酮誘導PC12細胞損傷的可能信號通路。
　　 3、觀察文拉法辛對皮質酮誘導的PC12細胞損傷過程中FoxO3a、Akt蛋白磷酸化表達的影響。
　　 4、觀察

9、文拉法辛保護作用是否是通過PI3K/Akt通路發(fā)揮作用的。
　　 5、觀察皮質酮以及文拉法辛對FoxO3a的亞細胞定位的影響。
　　 研究方法:
　　 1、建立由皮質酮誘導的PC12細胞損傷模型，觀察文拉法辛對細胞損傷模型的保護作用，分為正常組，模型組，文拉法辛給藥組，采用MTT assay，Hoechst stain檢測細胞存活率以及細胞狀態(tài)；Western Blot檢測FoxO3a、Akt等蛋白磷酸化水平。<

10、br>　　 2、采用通路阻斷劑預處理，觀察皮質酮誘導的PC12細胞損傷模型以及文拉法辛對細胞損傷模型的保護作用是否有所改變，采用MTT assay，Hoechst stain檢測細胞存活率以及細胞狀態(tài)；Western Blot 檢測FoxO3a、Akt等蛋白磷酸化水平。
　　 3、PC12細胞瞬時轉染GFP-FoxO3a質粒，采用皮質酮以及文拉法辛進行處理，觀察不同情況FoxO3a轉錄因子的亞細胞定位。
　　 研究結果

11、:
　　 1.皮質酮能夠劑量依賴性的誘導PC12細胞損傷，Hoechst33342熒光染色觀察皮質酮對PC12細胞凋亡的影響，以細胞萎縮、核固縮、染色質凝聚、凋亡小體形成和熒光強度增強等作為凋亡細胞指征，與正常組相比，模型組細胞狀態(tài)多見核染色質濃縮密集，邊緣化，形成深染團塊呈新月狀或戒指狀，位于核膜下，核破裂出芽形成凋亡小體等細胞凋亡及死亡細胞的形態(tài)學表現(xiàn)。MTT結果以及熒光染色結果顯示，與模型組相比，文拉法辛給藥組細胞明顯逆轉

12、由皮質酮誘導的細胞損傷，凋亡以及壞死細胞明顯減少。
　　 2.westem blot結果顯示，皮質酮處理能夠劑量和時間依賴性降低Akt、FoxO3a的磷酸化水平，文拉法辛給藥后能夠逆轉這種作用，升高磷酸化水平，發(fā)揮促存活作用。
　　 3.采用各通路阻斷劑預處理后，發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt通路抑制劑能夠逆轉文拉法辛對皮質酮誘導PC12細胞損傷的保護作用，并且明顯改變由皮質酮誘導的Akt、FoxO3a磷酸化水平的改變，而其他通路

13、抑制劑變化不明顯，說明文拉法辛對皮質酮誘導PC12細胞損傷的保護作用部分是通過PI3K/Akt通路發(fā)揮作用的。
　　 4.采用瞬時轉染GFP-FoxO3a質粒，結果顯示，皮質酮處理能夠明顯增加FoxO3a的核轉位，說明磷酸化水平降低；文拉法辛給藥后能夠促進FoxO3a的胞漿轉位，磷酸化水平增加，促凋亡作用被抑制從而發(fā)揮促存活結果。
　　 結論: PI3K/Akt/FoxO3a信號通路參與了文拉法辛對皮質酮誘導PC12細胞