牛結(jié)核分枝桿菌Mce4A和Mce4E蛋白與牛肺泡巨噬細胞相互作用的研究.pdf

1、牛結(jié)核病(Bovine-tuberculosis)是由牛結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium boris)引起的一種慢性、消耗性人獸共患傳染病。牛結(jié)核的致病機理主要與牛分枝桿菌在肺泡巨噬細胞中的存活/侵入能力有關(guān)，牛結(jié)核分枝桿菌侵入巨噬細胞的機制，主要是由哺乳動物細胞侵襲蛋白(Mammalian cell-entryproteins，Mce)介導(dǎo)的，在牛分枝桿菌的致病機理中具有重要的作用。為了闡明牛結(jié)核分枝桿菌侵入宿主細胞和在肺泡巨

2、噬細胞長期存活的機理，本研究利用基因重組技術(shù)表達牛結(jié)核分枝桿菌Mce4A和Mce4E蛋白，并對這兩個蛋白進行純化、復(fù)性，在體外獲得Mce4A和Mce4E蛋白，并對兩種蛋白與牛肺泡巨噬細胞的相互作用進行了研究，研究內(nèi)容如下： 1.以牛結(jié)核分枝桿菌的DNA為模板，通過PCR的方法擴增克隆Mce4A和Mce4E基因，將所擴增基因克隆于原核表達載體pET30a(+)并進行測序，結(jié)果顯示，Mce4A和Mce4E基因與GenBank上所公布

3、的牛結(jié)核分枝桿菌和人分枝桿菌Mce4A和Mce4E基因同源性為100％。將重組表達載體轉(zhuǎn)入宿主菌BL21進行誘導(dǎo)表達，表達蛋白經(jīng)SDS-PAGE分析和Western-blot免疫印跡鑒定，結(jié)果證明MceAA蛋白和MceAE蛋白獲得高效表達，表達量分別占菌體總量的52％和53.3％，分子量大小分別為43kDa和45kDa左右；利用Ni-NTA瓊脂糖柱對表達蛋白進行純化，純化率大于90％； 2.重組Mce4E蛋白質(zhì)能夠與兔抗牛結(jié)核分

4、枝桿菌陽性血清產(chǎn)生特異性反應(yīng)，說明重組蛋白具有牛分枝桿菌的抗原性，為進一步研究牛結(jié)核分枝桿菌快速診斷試劑盒和研究亞單位疫苗奠定了基礎(chǔ)。 3.純化的蛋白經(jīng)過透析復(fù)性、圓二色譜(CD)測定，結(jié)果表明，Mce4A蛋白和Mce4E蛋白均為典型的α螺旋型結(jié)構(gòu)，經(jīng)Jascow32軟件分析計算，Mce4A蛋白α螺旋含量為31.1％，β-折疊含量為0％，無規(guī)卷曲含量為61.0％，轉(zhuǎn)角含量為7.9％；Mce4E蛋白含有39.1％的α螺旋，60.9

5、％的無規(guī)卷曲，無β-折疊和轉(zhuǎn)角，為進一步開展牛結(jié)核分枝桿菌致病機理的研究和尋找新的藥物作用靶位點奠定了基礎(chǔ)。 4.用不同濃度的重組Mce4A蛋白和Mce4E蛋白刺激肺泡巨噬細胞，MTT檢測分析表明，兩種蛋白對牛肺泡巨噬細胞的活性有顯著的抑制作用(P<0.05)；用細胞凋亡-Hoechst染色試劑盒檢測，結(jié)果表明，兩種蛋白均不能引起肺泡巨噬細胞的凋亡。 5.用Mc04A蛋白、Mce4E蛋白、MtbPPD、MbPPD、BCG

6、和ConA分別刺激肺泡巨噬細胞48h后，Real-time PCR方法檢測結(jié)果顯示，Mce4A蛋白和Mce4E蛋白都能夠促使牛肺泡巨噬細胞TNF-α和IL-6 mRNA的表達上調(diào)(P<0.05)，而對IL-12表達沒有影響(P>0.05)。Mce4E蛋白抑制肺泡巨噬細胞fNOS的mRNA表達(P<0.05)，相反，Mce4A蛋白促使肺泡巨噬細胞fNOS的mRNA表達上調(diào)。Mce4A蛋白和Mce4E蛋白能夠促使肺泡巨噬細胞分泌炎性細胞因子