肝靶向基因治療AAV載體的篩選及其在OTCD基因治療中的應(yīng)用.pdf

1、背景：
　　 腺相關(guān)病毒(Adeno-associated virus，AAV)為單鏈DNA病毒，屬于細(xì)小病毒科(Parvoviridae)依賴病毒屬(Dependovirus)。基因組全長(zhǎng)～4.7 kb，不具有致病性及任何病理癥狀，需要輔助病毒的協(xié)助才能完成復(fù)制。自上個(gè)世紀(jì)六十年代初AAV2被首次發(fā)現(xiàn)以來(lái)，已從靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物體內(nèi)分離、鑒定出110多種AAV。早期研究證實(shí)AAV2載體能夠在多種組織細(xì)胞內(nèi)持續(xù)表達(dá)轉(zhuǎn)基因，且沒(méi)有載體相關(guān)

2、毒性和宿主免疫反應(yīng)。但是，隨后的研究發(fā)現(xiàn)AAV2有限的靶組織特異性、較低的轉(zhuǎn)基因效率、遲緩的基因表達(dá)以及人群中和抗體(neutralizing antibody，NAb)等因素限制了其在基因治療中的廣泛應(yīng)用。已有多個(gè)研究表明，來(lái)源于靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的新型AAV載體具有轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高、血清流行率低、免疫反應(yīng)弱等優(yōu)點(diǎn)。特別是AAV7、8、9等新型載體，在肝臟轉(zhuǎn)基因方面的表現(xiàn)尤為突出。近年來(lái)，隨著交叉包裝以及自身互補(bǔ)型AAV(Self-compleme

3、ntary AAV，scAAV)載體技術(shù)的發(fā)展，使得這些新型AAV廣泛應(yīng)用于肌肉、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Centralnervous system，CNS)、肝臟等組織的基因治療研究當(dāng)中。
　　 鳥(niǎo)氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶(Ornithine Transcarbamylase，OTC)為線粒體基質(zhì)同型三聚體酶，其在尿素循環(huán)系統(tǒng)中的主要作用是催化氨甲酰磷酸鹽和鳥(niǎo)氨酸合成瓜氨酸。鳥(niǎo)氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶缺乏癥(OrnithineTranscarbam

4、ylase Deficiency，OTCD)是一種X連鎖半顯性遺傳疾病，主要是由于OTC基因突變而引起，發(fā)病率約為1/14，000。目前，已經(jīng)從人類(lèi)OTC基因內(nèi)鑒定出341個(gè)致病突變和29個(gè)非致病突變。OTCD表型具有多樣性，OTC完全缺失的半合子男性患兒一般在出生后1個(gè)星期內(nèi)出現(xiàn)急性高氨血癥，而雜合子女性患兒和OTC部分缺失的男性患兒則在嬰兒后期乃至成人期發(fā)病。OTCD的臨床癥狀主要包括由高氨血癥引起的嗜睡、嘔吐、抽搐或肢體行為異常，

5、更嚴(yán)重者會(huì)昏迷，腦水腫或死亡。理化特征為血漿中谷氨酸濃度上升，瓜氨酸濃度降低或檢測(cè)不到，尿液中乳清酸濃度上升。目前，OTCD的治療手段主要是嚴(yán)格監(jiān)護(hù)、長(zhǎng)期控制飲食蛋白并結(jié)合苯丁酸鈉旁路治療來(lái)控制病情，徹底矯正OTC活性的治療方式只能通過(guò)肝移植來(lái)實(shí)現(xiàn)。
　　 目的：
　　 分別以小鼠和非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物(non-human primate，NHP)為模型，對(duì)肝靶向轉(zhuǎn)基因AAV載體進(jìn)行全面、系統(tǒng)的評(píng)估和篩選，并將該載體應(yīng)用于OT

6、CD基因治療的研究。
　　 方法：
　　 首先以小鼠為動(dòng)物模型，從轉(zhuǎn)基因效率、轉(zhuǎn)基因穩(wěn)定性、肝臟毒性、血清NAb、免疫反應(yīng)以及組織分布等方面，對(duì)7種用于肝臟基因治療新型AAV載體(AAV8，6.2，7，rh.64R1，hu.37，rh.8，rh.32.33)的生物學(xué)特性進(jìn)行全面系統(tǒng)的評(píng)估。然后在此基礎(chǔ)上選出3種載體，在NHP中(恒河猴)做進(jìn)一步的評(píng)估，以期選出最適于臨床肝臟轉(zhuǎn)基因AAV載體。
　　 將上述新型AA

7、V8衣殼結(jié)合scAAV載體技術(shù)，構(gòu)建AAV2/8.sc.TBG.mOTC載體，以Spf-ash小鼠為模型，從尿液乳清酸、肝臟OTC活性、OTC蛋白表達(dá)、NH4Cl攻擊試驗(yàn)以及載體分布等方面評(píng)價(jià)該載體在OTCD基因治療中的效率。同時(shí)以新生C57Bl/6小鼠(<24小時(shí))為模型，初步探索scAAV載體的轉(zhuǎn)基因效率和穩(wěn)定性。
　　 結(jié)果：
　　 1、通過(guò)對(duì)7種用于肝臟基因治療新型AAV載體(AAV8，6.2，7，rh.64R1

8、，hu.37，rh.8，rh.32.33)在小鼠體內(nèi)的系統(tǒng)評(píng)估，綜合分析各種載體在轉(zhuǎn)基因效率、轉(zhuǎn)基因穩(wěn)定性、肝臟毒性、血清NAb、免疫反應(yīng)以及組織分布等方面的表現(xiàn)，從分?jǐn)?shù)上可將7種載體分為高、中、低3組：高-AAVhu.37(1.5)和AAVrh.8(0.5)；中-AAV8(-2)、AAVrh.64R1(-2)、AAV7(-4)；低-AAV6.2(-12)和AAVrh.32.33(-17.5)。
　　 2、本研究的最初目的是以恒

9、河猴為模型，對(duì)3種AAV(AAV8、hu.37、rh.8)的肝臟轉(zhuǎn)基因效率和安全性做進(jìn)一步的評(píng)價(jià)。但在試驗(yàn)過(guò)程中我們發(fā)現(xiàn)，由于自然感染而產(chǎn)生的低水平AAV NAb對(duì)載體的轉(zhuǎn)基因作用產(chǎn)生了嚴(yán)重的影響。AAV8轉(zhuǎn)導(dǎo)效率與先存NAb間的關(guān)系相對(duì)清晰，即使1：5的NAb便可影響載體在恒河猴體內(nèi)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。但本研究未能總結(jié)出AAVhu.37、AAVrh.8 NAb與轉(zhuǎn)導(dǎo)效率間的關(guān)系。這是因?yàn)楝F(xiàn)有NAb分析方法(體外/體內(nèi))無(wú)法準(zhǔn)確的檢測(cè)出以上兩種AA

10、V的實(shí)際NAb水平。本研究發(fā)現(xiàn)抗原性轉(zhuǎn)基因綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)在研究期限內(nèi)(35天)能夠獲得持續(xù)的表達(dá)。這可能是由于肝臟特異性TBG啟動(dòng)子的使用，在一定程度上避免了細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(cytotoxic Tymphocyte cell，CTL)對(duì)多數(shù)動(dòng)物體內(nèi)GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的殺傷作用。因此，從現(xiàn)有的研究結(jié)果來(lái)看，AAV8最適于作為臨床肝臟基因治療載體，這是因?yàn)椋?)轉(zhuǎn)導(dǎo)效率最高；2)目前

11、的分析方法能夠有效的檢測(cè)其N(xiāo)Ab。
　　 3、AAV2/8.sc.TBG.mOTC1.1載體具有較快的起效時(shí)間，并起到一定的治療作用。注射Spf-ash小鼠3天后尿液乳清酸水平開(kāi)始下降，7天后恢復(fù)至正常值。肝臟OTC活性也于7天后開(kāi)始明顯升上，14天后達(dá)到正常值的35.4％，此時(shí)Spf-ash小鼠對(duì)NH4Cl攻擊的抵抗能力也基本達(dá)到正常小鼠水平。通過(guò)對(duì)mOTC基因表達(dá)盒的優(yōu)化，使載體的效率進(jìn)一步提高。注射載體14天后，肝臟OTC

12、活性為正常小鼠的1.5倍，OTC陽(yáng)性細(xì)胞>80％。
　　 4、AAV2/8.sc.TBG.EGFP載體能夠在新生小鼠(<24小時(shí))肝臟內(nèi)高效表達(dá)GFP。特別是在高劑量組中(2×1011GC)，載體注射后3天GFP陽(yáng)性細(xì)胞超過(guò)85％。但1個(gè)星期后，隨著肝細(xì)胞大量增殖而導(dǎo)致GFP表達(dá)水平開(kāi)始逐漸下降，至第3個(gè)星期GFP僅存5％左右，并穩(wěn)定維持在該水平直至第5個(gè)星期。這些結(jié)果表明：(1) scAAV2/8載體能夠在新生小鼠肝臟內(nèi)迅速高

13、效的表達(dá)轉(zhuǎn)基因(7天)。(2)由于轉(zhuǎn)基因丟失，有必要在首次注射載體后14-21天期間，以不同血清型AAV載體(如AAV5)經(jīng)不同給藥途徑(如i.p.)進(jìn)行加強(qiáng)注射，以期維持轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平。
　　 結(jié)論：
　　 通過(guò)在小鼠及NHP動(dòng)物模型中的全面系統(tǒng)評(píng)估，與其它新型AAV相比，AAV8載體具有極為突出的肝臟轉(zhuǎn)基因效率和安全性。在充分結(jié)合scAAV載體起效快、轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高等優(yōu)點(diǎn)的前提下，scAAV8載體在Spf-ash小鼠OT