IL-24對(duì)小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：構(gòu)建含有目的基因 IL-24的真核表達(dá)質(zhì)粒 pEGFP-N1-IL-24，將其轉(zhuǎn)染小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞，研究IL-24在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)對(duì)腫瘤細(xì)胞的凋亡和體外增殖的影響。
　　方法：將pUC57-IL-24用限制性核酸內(nèi)切酶雙酶切后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收、純化，與pEGFP-N1相連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞E.coli DH5α中，提取質(zhì)粒，再次酶切電泳，檢查IL-24插入pEGFP-N1的準(zhǔn)確性，并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。用脂質(zhì)體

2、法將 pEGFP-N1-IL-24轉(zhuǎn)染 B16細(xì)胞（B16/pEGFP-N1-IL-24組)，同時(shí)設(shè)未處理的B16細(xì)胞(B16組)作對(duì)照組，另外將只加入脂質(zhì)體的B16細(xì)胞(B16/Lip組)作脂質(zhì)體組，pEGFP-N1轉(zhuǎn)染的B16細(xì)胞（B16/pEGFP-N1組）作空載體組，加入長(zhǎng)春新堿的B16細(xì)胞(B16/VCR組)作化療藥組，24h后在熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞的表達(dá)，于轉(zhuǎn)染48h后在倒置顯微鏡高倍鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，用吖啶橙/

3、溴化乙錠（AO/EB）法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，用MTT法檢測(cè)B16細(xì)胞的體外增殖能力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用x±s表示，用統(tǒng)計(jì)軟件做t檢驗(yàn)，P<0.05時(shí)有顯著性差異。
　　結(jié)果：
　　1.將構(gòu)建的含有IL-24的真核表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)酶切、電泳，發(fā)現(xiàn)了4.7kb和660bp的條帶，與預(yù)期值相符，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證為pEGFP-N1-IL-24基因序列。
　　2.將B16、B16/Lip、B16/pEGFP-N1、B16/pEGFP-N1-IL-24、B

4、16/VCR五組細(xì)胞分別于轉(zhuǎn)染后24h在熒光顯微鏡下觀察，可見 B16/pEGFP-N1組細(xì)胞和B16/pEGFP-N1-IL-24組細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，說明EGFP基因在B16細(xì)胞中有表達(dá)，而其他組細(xì)胞未見綠色熒光。
　　3.觀察B16、B16/Lip、B16/pEGFP-N1、B16/pEGFP-N1-IL-24、B16/VCR五組細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后48h的細(xì)胞形態(tài)，可見，B16組、B16/Lip組和B16/pEGFP-N1組細(xì)胞，因

5、細(xì)胞分裂增殖而滿視野，細(xì)胞大小類似，呈圓形、橢圓形或短梭型，細(xì)胞外周清晰，立體感強(qiáng)。B16/pEGFP-N1-IL-24組和B16/VCR組細(xì)胞，大多細(xì)胞的周邊較模糊，成團(tuán)緊密聚集，細(xì)胞數(shù)量少，有碎片，大小不規(guī)則。
　　4. B16、B16/Lip、B16/pEGFP-N1、B16/pEGFP-N1-IL-24、B16/VCR五組細(xì)胞分別進(jìn)行 AO/EB雙熒光染色，結(jié)果表明 B16組、B16/Lip組和B16/pEGFP-N1組細(xì)

6、胞大多為核染色質(zhì)著綠色，并呈正常結(jié)構(gòu)，有少量死亡細(xì)胞，即核染色質(zhì)著紅色并呈正常結(jié)構(gòu)；B16/pEGFP-N1-IL-24組和B16/VCR組細(xì)胞大多為凋亡細(xì)胞，核染色質(zhì)為橘黃色或橙紅色，并呈固縮狀或圓珠狀。
　　5.將B16、B16/Lip、B16/pEGFP-N1、B16/pEGFP-N1-IL-24、B16/VCR五組細(xì)胞用 MTT進(jìn)行比色法測(cè)定，B16/pEGFP-N1-IL-24組與 B16/Lip組、B16/pEGFP-

7、N1-IL-24與B16/pEGFP-N1的抑制率有顯著性差異（P<0.05，P<0.05），而B16/pEGFP-N1-IL-24組與B16/VCR組的抑制率無明顯差異（P=0.991）。由轉(zhuǎn)染后48h，B16細(xì)胞由抑制率而做的直方圖可以看出，B16/pEGFP-N1-IL-24組和 B16/VCR組細(xì)胞的增殖與 B16/Lip組和B16/pEGFP-N1組相比明顯受到抑制。
　　結(jié)論：
　　1.成功構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒 p