小鼠巨細胞病毒感染對乳鼠海馬突觸數(shù)目及突觸相關蛋白的影響研究.pdf

1、第一部分 MCMV 感染對乳鼠海馬突觸數(shù)目及突觸相關蛋白的影響
　　 目的：研究MCMV 感染對乳鼠海馬神經(jīng)元突觸數(shù)目及突觸相關蛋白表達的影響。
　　 方法：①體外細胞培養(yǎng)法傳毒增殖MCMV Smith 毒株，Reed-Muench 法計算病毒毒力。②建立乳鼠腦組織MCMV 感染模型：ELISA 法篩選MCMV IgM和IgG 均為陰性的BALB/C 小鼠，雌雄小鼠同籠受孕。仔鼠出生當天，按窩隨機分為實驗組和對照組。實驗

2、組（n=90）顱內接種MCMV 病毒懸液10μl，對照組（n=90）顱內接種等量的細胞維持液。無菌采集接種后3d、15d、30d 腦組織各30只，應用PCR法檢測其MCMV 感染情況，實驗組內MCMV DNA陽性以及對照組內MCMV DNA陰性腦組織用于后續(xù)試驗。③應用免疫熒光標記SYP，并在激光共聚焦顯微鏡下觀察各組乳鼠海馬SYP 熒光顆粒數(shù)目，以此代表突觸數(shù)目。④應用Real-time qPCR、免疫組織化學方法及Western b

3、lot 法檢測各組乳鼠海馬突觸相關蛋白SYP、PSD-95及AMPA受體GluR2 亞基的編碼基因轉錄水平及蛋白質表達水平。
　　 結果：MCMV ① Smith 毒株的TCID50 為10-4.5/0.1ml。②實驗組小鼠腦組織中均可檢見MCMV DNA，對照組小鼠腦組織中未檢見MCMV DNA。③隨日齡增加，兩組乳鼠海馬SYP 熒光顆粒數(shù)目不斷增加；與對照組比較，實驗組各時相乳鼠海馬SYP熒光顆粒數(shù)目均減少，其中第15d和第

4、30d 減少更為明顯，差異具有統(tǒng)計學意義。④
　　 隨日齡增加，兩組乳鼠海馬SYP、PSD-95及AMPA 受體GluR2 亞基編碼基因轉錄水平及蛋白質表達水平均不斷增高；與對照組比較，實驗組各時相三種蛋白的編碼基因轉錄水平及蛋白質表達水平均降低，其中，第15d和第30d下降更明顯，差異具有統(tǒng)計學意義。
　　 結論：①MCMV 感染可導致發(fā)育中的乳鼠海馬突觸形成數(shù)目減少，并且隨著日齡的增加，其影響更為明顯。②MCMV 可

5、導致發(fā)育過程中的乳鼠突觸相關蛋白SYP、PSD-95及AMPA 受體GluR2 亞基的編碼基因轉錄水平及蛋白質表達水平下降。
　　 第二部分 MCMV 感染后星形膠質細胞分泌產(chǎn)物對神經(jīng)元突觸的影響
　　 目的：研究MCMV 感染后星形膠質細胞分泌產(chǎn)物對神經(jīng)元突觸數(shù)目及突觸相關蛋白表達的影響。
　　 方法：①建立星形膠質細胞MCMV感染模型：原代及傳代培養(yǎng)乳鼠海馬星形膠質細胞；應用免疫細胞化學方法檢測星形膠質細胞特

6、異性標記物GFAP的表達情況，鑒定并檢測星形膠質細胞的純度；以100TCID50 MCMV攻擊星形膠質細胞后，通過PCR檢測MCMV DNA、觀察細胞培養(yǎng)液對NIH 3T3細胞的細胞毒作用、CCK-8法檢測MCMV對星形膠質細胞存活率的影響，以及繪制MCMV在星形膠質細胞內的生長曲線等方法，判定星形膠質細胞對MCMV的易感性、感染狀態(tài)以及MCMV在細胞內的生長情況。②建立星形膠質細胞培養(yǎng)液（Astrocyte conditioned m

7、edium，ACM）與神經(jīng)元共培養(yǎng)體系：原代培養(yǎng)乳鼠海馬神經(jīng)元；應用免疫細胞化學方法檢測神經(jīng)元特異性標記物NSE的表達情況，鑒定并檢測神經(jīng)元的純度；以100TCID50 MCMV攻擊傳代培養(yǎng)的星形膠質細胞，收集MCMV感染后6、12、24、48、72h以及相同時間點的對照組ACM，過濾及離心后用紫外燈照射15min滅活CMV；應用CCK-8法檢測不同濃度ACM對神經(jīng)元存活的影響，以確定最佳的ACM濃度應用于后續(xù)實驗；根據(jù)神經(jīng)元細胞培養(yǎng)液

8、各組分不同，分為實驗組（含最佳濃度的各不同時間點感染ACM）、ACM對照組（含最佳濃度的各不同時間點正常ACM）及空白對照組（不含ACM）。③應用免疫熒光標記SYP，并在熒光顯微鏡下觀察各組神經(jīng)元突觸數(shù)目，以此代表突觸數(shù)目。④應用Real-time qPCR及免疫細胞化學方法檢測各組神經(jīng)元突觸相關蛋白SYP、PSD-95及AMPA受體GluR2亞基的編碼基因轉錄水平及蛋白質表達水平。
　　 結果：①體外培養(yǎng)星形膠質細胞（純度達9

9、5％以上）感染MCMV后發(fā)生典型細胞病變；在MCMV 感染48h的星形膠質細胞內可以檢測到MCMV IE DNA的表達；
　　 感染后3d~4d的ACM 可使NIH 3T3細胞發(fā)生典型的CMV 病毒蝕斑；星形膠質細胞在感染MCMV后24h 開始死亡，感染后72h 大部分細胞死亡，至感染后96h細胞幾乎全部死亡；MCMV在星形膠質細胞內的復制于感染后12h 開始增高，72h 達到高峰。
　　 ②體外培養(yǎng)神經(jīng)元的純度可達98

10、％以上，培養(yǎng)基含50％ACM 時神經(jīng)元存活率最高。
　　 ③與空白對照組相比，ACM 對照組和實驗組12h~72h SYP 熒光顆粒數(shù)目均明顯增多（P<0.01）；與ACM 對照組比較，實驗組12h~72h SYP 熒光顆粒數(shù)目均明顯減少（P<0.01）。組內比較發(fā)現(xiàn)，ACM 對照組12h、24h、48h SYP 熒光顆粒數(shù)目均比前一時相明顯升高（P<0.01），72h 變化不明顯（P>0.05）；實驗組僅12h SYP 熒光顆

11、粒數(shù)比前一時相明顯升高（P<0.01），24h、48h、72h 變化不明顯（P>0.05）。④與空白對照組比較，ACM 對照組和實驗組12~72h 三種蛋白的編碼基因轉錄水平及蛋白質表達水平均顯著升高（P<0.01）。與ACM 對照組比較，實驗組12~72h 三種蛋白的編碼基因轉錄水平及蛋白質表達水平均顯著降低（P<0.01）。組內比較發(fā)現(xiàn)，ACM 對照組12h、24h、48h 三種蛋白的編碼基因轉錄水平及蛋白質表達水平均比前一時相明顯

12、升高（P<0.01），72h 變化不明顯（P>0.05）；實驗組僅12h 三種蛋白的編碼基因轉錄水平及蛋白質表達水平均比前一時相明顯升高（P<0.0.1），24h、48h、72h 變化不明顯（P>0.05）。
　　 結論：①MCMV 可在傳代培養(yǎng)的星形膠質細胞內復制、產(chǎn)毒并產(chǎn)生致細胞病變效應。②星形膠質細胞分泌物可促進突觸形成，MCMV 可能通過影響星形膠質細胞的合成及分泌功能而使突觸形成減少。③星形膠質細胞分泌物可促進神經(jīng)元突

13、觸相關蛋白的編碼基因轉錄及蛋白質表達，MCMV 可能通過影響星形膠質細胞分泌功能而干擾神經(jīng)元突觸相關蛋白的編碼基因轉錄及蛋白質表達。
　　 第三部分 MCMV 感染對星形膠質細胞合成分泌TSP-1 及TNF-α的影響
　　 目的：研究MCMV 對星形膠質細胞合成分泌TSP-1 及TNF-α的影響。
　　 方法：傳代培養(yǎng)星形膠質細胞，分為實驗組和對照組。實驗組加入100 TCID50MCMV 及細胞維持液，對照組加

14、入細胞維持液。收集6、12、24、48、72h的細胞和ACM，ACM 過濾及離心后用紫外燈照射15min 滅活CMV。①應用Real-time qPCR及免疫細胞化學方法檢測MCMV 感染對星形膠質細胞TSP-1、TNF-αmRNA 及蛋白質表達水平的影響。②應用ELISA 法檢測MCMV 感染對星形膠質細胞分泌TSP-1 及TNF-α的影響。
　　 結果：①與對照組比較，實驗組各時相TSP-1 及TNF-αmRNA 及蛋白質表

15、達水平均降低（P 均<0.01）；感染時間越長，表達水平越低，差異越大。組內比較發(fā)現(xiàn)，感染組12h~72h表達水平均低于前一時相（P 均<0.05）。②星形膠質細胞培養(yǎng)12h后才能在ACM中檢測到TSP-1 及TNF-α；對照組TSP-1 及TNF-α含量在48h 內迅速升高（與前一時相比較，P 均<0.05），72h 升高速度減慢；與對照組比較，實驗組各時相TSP-1 及TNF-α含量均減少（P 均<0.01），且12h~72h 含量