PinlshRNA慢病毒載體構(gòu)建及其對高氧誘導人肺泡上皮細胞凋亡的影響.pdf

1、本研究基金來源：1中華兒科雜志第二屆雙鶴珂立蘇科研基金(編號：cjp009)2四川省教育廳科研項目基金(編號：08ZAISO一033)3四川省衛(wèi)生廳科研基金(編號：110340)4瀘州市科技局(瀘州市政府瀘州醫(yī)學院聯(lián)合專項資金)(編號：2013LZLYJ08)PinlshRNA慢病毒載體的構(gòu)建及其對高氧誘導人肺泡上皮細胞凋亡的影響摘要目的：Pinl是人類肽基脯氨酰異構(gòu)酶，現(xiàn)在主要用于研究抑制腫瘤細胞的靶點。而目前研究發(fā)現(xiàn)，Pinl參與氧

2、化應激通路，抑制其表達將可能減少高氧肺損傷，但具體作用機制研究鮮有報道。RNAi技術(shù)是目前公認能夠快速有效的基因沉默方式，其可高效、特異性下調(diào)目標基因的表達，研究基因功能和信號轉(zhuǎn)導途徑，越來越受到人們的關(guān)注。本實驗擬構(gòu)建PinlshRNA慢病毒載體，建立穩(wěn)定抑制肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶(Pinl)表達的A549細胞系，從而探討Pinl在氧化應激通路介導高氧誘導人肺泡II型上皮A549細胞凋亡的影響，抑制其表達后是否對高氧誘導肺泡上皮細胞的保

3、護作用。方法：根據(jù)查閱文獻獲得PinlshRNA干擾靶點序列并插入pLenRGPH載體，構(gòu)建pLenRGPHPinlshRNA慢病毒載體，隨后轉(zhuǎn)入人胚腎HEK293T細胞中，收集其上清進行病毒滴度測定，再行慢病毒的包裝，將獲得的慢病毒毒液感染A549。通過實時定量PCR(qRTPCR)及Westernblot法檢測Pinl在不同組的表達抑制情況，最終獲得穩(wěn)定抑制Pinl表達的A549PinlshRNA細胞系。隨后將實驗分為四組：空氣組、