ETEC F41菌毛基因的原核表達(dá)及其重組質(zhì)粒的遺傳穩(wěn)定性研究.pdf

1、產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌(Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC)是引起人和幼畜(初生仔豬、犢牛、羔羊、斷奶仔豬)腹瀉的重要病原之一。我國(guó)乃至世界因ETEC引起的新生幼畜腹瀉發(fā)病率和死亡率都很高，給畜牧業(yè)帶來(lái)了極大危害，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。ETEC的致病力與其黏附素性菌毛和腸毒素二者密切相關(guān)且缺一不可，黏附素性菌毛的黏附作用是該菌致病的先決條件。因此，以抗黏附免疫為基礎(chǔ)的黏附素疫苗的研制是疫苗研制的重點(diǎn)。

2、F41菌毛是ETEC所攜帶的主要菌毛抗原之一，是研發(fā)新型疫苗的理想候選抗原。目前國(guó)內(nèi)對(duì)于構(gòu)建單一F41菌毛基因工程菌株的研究未見(jiàn)報(bào)道。 本文利用PCR技術(shù)從牛源ETEC標(biāo)準(zhǔn)菌株C83919的染色體DNA中擴(kuò)增出F41菌毛基因，構(gòu)建T7啟動(dòng)子控制下的原核表達(dá)載體pEF-32a(+)-F41，對(duì)其進(jìn)行序列分析，結(jié)果表明：與GenBank中公布的序列相比較，DNA一致性在99.6％以上；將重組子轉(zhuǎn)化至感受態(tài)E.coliBL21(DE3

3、)中，IPTG誘導(dǎo)后，經(jīng)SDS-PAGE和Western blot分析，均可見(jiàn)約49.8kDa的目的蛋白帶，且目的蛋白主要存在于菌體裂解上清中，為可溶性表達(dá)；對(duì)表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化，經(jīng)Bandscan軟件分析，表達(dá)的目的蛋白約占菌體總蛋白的32％；通過(guò)Ni-NTA agarose純化，獲得較高純度的重組蛋白，經(jīng)基因定量?jī)x測(cè)定其濃度可達(dá)1.84mg/mL；以其免疫家兔獲得多抗血清，Western blot分析證實(shí)該重組蛋白具有良好的抗原性，

4、可以作為診斷抗原。 為考察所構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET-32a(+)-F41在E.coli BL21(DE3)菌種中的遺傳穩(wěn)定性，將菌種分別在氨芐青霉素選擇平板和非選擇平板上連續(xù)傳代至50代，對(duì)菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算分離穩(wěn)定性達(dá)到95％以上；觀察傳代后菌落及菌體形態(tài)依然保持了原代菌體形態(tài)特征；提取原代、30代、40代、50代質(zhì)粒DNA進(jìn)行雙酶切檢查，酶切圖譜沒(méi)有改變；對(duì)傳代前后菌株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE和Western blot分析