線粒體融合蛋白2和膠質(zhì)纖維酸性蛋白在脊髓損傷及體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞劃傷后表達(dá).pdf

1、目的：通過檢測(cè)脊髓損傷及體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞劃傷后線粒體融合蛋白-2(mitofusions-2,Mfn2)和膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein,GFAP)的表達(dá)變化,為下一階段進(jìn)行Mfn2過表達(dá)抑制脊髓損傷(spinalcordinjury,SCI)后星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的研究提供基礎(chǔ)。
　　方法：建立大鼠脊髓損傷模型和體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞劃傷模型,運(yùn)用免疫熒光和WesternBlotting

2、方法,檢測(cè)Mfn2和GFAP表達(dá)變化。第一部分:清潔級(jí)成年雄性SD大鼠48只,隨機(jī)分為兩組:假手術(shù)組(sham組,n=24),脊髓損傷組(SCI組,n=24),SCI組采用Allen's法建立大鼠胸段脊髓損傷模型,假手術(shù)組只行椎板切除術(shù),分別于術(shù)后第1天、第3天、第7天、第14天四個(gè)時(shí)間點(diǎn)分批處死大鼠,取大鼠胸段脊髓組織,行組織免疫熒光染色觀察脊髓形態(tài)變化,WesternBlotting檢測(cè)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)Mfn2和GFAP的表達(dá)變化。第二部

3、分:原代培養(yǎng)純化的星形膠質(zhì)細(xì)胞傳代后種于直徑3.5cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿,隨機(jī)分為對(duì)照組(n=6)、1小時(shí)組(n=6)、12小時(shí)組(n=6)、24小時(shí)組(n=6)、48小時(shí)組(n=6),待培養(yǎng)皿中星形膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)80-90％融合度后,用無(wú)菌黃槍頭行“井”字形劃傷細(xì)胞,對(duì)照組不做任何處理,分別于劃傷后1小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)四個(gè)時(shí)間點(diǎn)時(shí),采用細(xì)胞免疫熒光染色觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocyte,AS)形態(tài)變化,WesternBlo

4、tting檢測(cè)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)Mfn2和GFAP的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：①大鼠脊髓組織進(jìn)行免疫熒光染色,正置熒光顯微鏡下觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn):脊髓損傷后,大鼠胸段脊髓灰質(zhì)兩背角之間會(huì)形成結(jié)構(gòu)紊亂、邊界不清的損傷灶;WesternBlotting結(jié)果顯示脊髓損傷后,大鼠胸段脊髓Mfn2蛋白表達(dá)從第1天開始下降,與sham組相比,脊髓損傷組胸段脊髓Mfn2表達(dá)整體呈下降趨勢(shì),術(shù)后第3天開始明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05),GFAP表達(dá)隨時(shí)

5、間延長(zhǎng)則逐漸增加,術(shù)后第3天開始差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。②細(xì)胞免疫熒光結(jié)果發(fā)現(xiàn)劃傷后離體培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生,細(xì)胞體積增大、突起增多,胞內(nèi)Mfn2表達(dá)下降;WesternBlotting結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,劃傷組星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)Mfn2表達(dá)整體也呈下降趨勢(shì),第12小時(shí)開始出現(xiàn)明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05),而GFAP表達(dá)整體呈上升趨勢(shì),第24h時(shí)才開始出現(xiàn)明顯上升,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。

6、>　　結(jié)論：①脊髓損傷及體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞劃傷后,星形膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)志物GFAP表達(dá)整體呈上升趨勢(shì),提示此時(shí)體內(nèi)及體外AS均出現(xiàn)大量增殖;與此相反,脊髓損傷及體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞劃傷后,Mfn2這種增殖抑制基因的表達(dá)產(chǎn)物Mfn2蛋白則表達(dá)減少?？梢?脊髓損傷及體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞劃傷后,星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖與活化程度與Mfn2的表達(dá)量呈現(xiàn)反比關(guān)系,提示脊髓中內(nèi)源性Mfn2表達(dá)減少可能在脊髓損傷后AS過度活化過程中扮演重要角色。②首次