KLF4在富集結(jié)腸癌干細(xì)胞的球細(xì)胞中發(fā)揮原癌作用.pdf

1、背景:結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)嚴(yán)重制約著臨床療效,目前對(duì)于其機(jī)制尚不明確。腫瘤干細(xì)胞理論認(rèn)為,腫瘤干細(xì)胞的自我更新和分化能力決定著腫瘤的轉(zhuǎn)歸,介導(dǎo)其轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等行為。核轉(zhuǎn)錄因子KLF4(Krüppel-likefactor4)在維持干細(xì)胞的自我更新和分化過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。而正常干細(xì)胞與腫瘤干細(xì)胞極為相似,所以有必要明確KLF4在正常干細(xì)胞與腫瘤干細(xì)胞中是否存在相同或相似的調(diào)控機(jī)制。在結(jié)腸癌中KLF4被認(rèn)為是抑癌基因,但是這些報(bào)道都基于臨床及

2、普通結(jié)腸癌細(xì)胞研究,目前還未見(jiàn)KLF4在結(jié)腸癌腫瘤干細(xì)胞中的表達(dá)及功能研究。我們發(fā)現(xiàn),KLF4高表達(dá)于富集腫瘤干細(xì)胞的細(xì)胞群中?？紤]到KLF4在維持干細(xì)胞自我更新過(guò)程中發(fā)揮的關(guān)鍵作用,則其在結(jié)腸癌干細(xì)胞中是繼續(xù)發(fā)揮抑癌效應(yīng)還是作為原癌基因維持其自我更新?
　　目的:明確KLF4表達(dá)變化對(duì)富集結(jié)腸癌干細(xì)胞的球細(xì)胞惡性行為的影響,以期揭示KLF4在結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)中的作用。
　　方法:Real-timePCR、Western-b

3、lot檢測(cè)結(jié)腸癌細(xì)胞系及正常結(jié)腸上皮細(xì)胞FHC中KLF4表達(dá)情況。將結(jié)腸癌DLD-1細(xì)胞行無(wú)血清培養(yǎng)獲得DLD-S球細(xì)胞,檢測(cè)其中KLF4、結(jié)腸癌干細(xì)胞基因的表達(dá);Transwell檢測(cè)轉(zhuǎn)移、侵襲能力;裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)及軟瓊脂克隆、平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)體內(nèi)外成瘤能力;CCK-8法檢測(cè)耐藥能力變化。免疫磁珠法分選CD133+及CD133-細(xì)胞,Real-timePCR檢測(cè)其中KLF4表達(dá)差異。免疫熒光檢測(cè)KLF4與CD133在DLD-1及DL

4、D-S中的表達(dá)。設(shè)計(jì)KLF4shRNA慢病毒載體,轉(zhuǎn)染球細(xì)胞后檢測(cè)KLF4、結(jié)腸癌干細(xì)胞基因的表達(dá)及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)基因表達(dá)變化;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD133+細(xì)胞比例變化;細(xì)胞再次行無(wú)血清培養(yǎng)檢測(cè)其自我更新能力差異;再次檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移、侵襲、體內(nèi)外成瘤能力、耐藥能力變化。
　　結(jié)果:相對(duì)于正常結(jié)腸上皮FHC,結(jié)腸癌中KLF4表達(dá)量低(P<0.05)。相比DLD-1,DLD-S中KLF4、結(jié)腸癌干細(xì)胞基因表達(dá)明顯升高(P<0.05);D

5、LD-S細(xì)胞已發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(P<0.05);球細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的侵襲、轉(zhuǎn)移、耐藥及體內(nèi)外成瘤能力(P<0.05);相較于CD133-細(xì)胞,CD133+細(xì)胞中KLF4也明顯升高(P<0.05);免疫熒光也證實(shí)KLF4與CD133共同表達(dá)在DLD-S細(xì)胞中;沉默DLD-S中KLF4表達(dá)后,KLF4、CD133、CD166、Lgr5、ALDH1表達(dá)均下降(P<0.05);CD133+細(xì)胞比例下降(P<0.05);侵襲、轉(zhuǎn)移、耐藥及體內(nèi)外成瘤