KLF4與ATO通過調(diào)控Wnt信號通路在套細胞淋巴瘤中發(fā)揮抗腫瘤作用的機制研究.pdf

1、套細胞淋巴瘤(MCL)來源于淋巴結(jié)濾泡外套B細胞異常增殖，以染色體t(11;14)(q13; q32)易位導致細胞周期蛋白cyclin D1的過表達為特征，多見于老年男性，發(fā)展迅速，屬侵襲性淋巴瘤，傳統(tǒng)化療后復發(fā)率高，預后不佳，中位生存期僅為3-5年;因此積極探索疾病發(fā)病機制，尋找特異性腫瘤標志物和有效靶向治療成為最具潛力的突破方向。
　　Krüppel樣因子(Krüppel-like factor, KLF)是一類在人類組織中廣

2、泛表達的含鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子。KLF家族蛋白在許多不同的生理活動如細胞增殖、生長、分化和正常組織穩(wěn)態(tài)的維持中發(fā)揮重要作用。KLF4基因包含3個結(jié)構(gòu)域:DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域和核定位序列。其中高度保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域位于羧基端，一般用來調(diào)節(jié)DNA結(jié)合的特異性;轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域位于氨基端，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活或抑制作用。KLF4在不同的腫瘤組織中可以通過與不同的靶基因作用，發(fā)揮促癌或者抑癌兩種完全相反的功能。KLF4在乳腺導管癌和口腔鱗癌

3、中表達上調(diào)，被認為是癌基因;而在胃腸道腫瘤如食管鱗癌、胃癌、結(jié)腸直腸癌，肺癌、膀胱癌、前列腺癌中表達減低發(fā)揮抑癌作用。在血液病研究中發(fā)現(xiàn)，KLF4在彌漫大B細胞淋巴瘤、濾泡淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤和cHL中發(fā)揮抑癌基因的作用且常發(fā)生因基因啟動子甲基化導致的沉默。而KLF4在MCL中的表達水平及作用尚未有明確報道。
　　Wnt信號通路在B細胞的正常分化增殖中高度保守且具有重要意義，近期研究表明Wnt/β-catenin通路在MC

4、L中都處于異?；罨癄顟B(tài)，并與腫瘤的發(fā)生進展密切相關。正常狀態(tài)下，β-catenin由GSK-3β等組成的復合物磷酸化降解并在細胞中保持低水平表達。細胞受到異常刺激時，GSK-3β組成的復合物活性受抑制，大量非磷酸化β-catenin在細胞質(zhì)中積聚并轉(zhuǎn)入細胞核中，β-catenin在細胞核中與TCF形成復合體使得下游如c-myc，cyclin D1，MMP7等與細胞增殖、侵襲相關基因異常激活，從而參與促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。有文獻報道KLF4

5、在胃腸道腫瘤中可通過抑制Wnt/β-catenin通路發(fā)揮抗腫瘤作用;在多能干細胞研究中KLF4與β-catenin協(xié)同誘導端粒酶催化亞單位的表達，從而參與細胞生長的調(diào)控。
　　砷劑早在古希臘和古代中國時期就被當做藥物和毒藥使用。三氧化二砷(ATO)聯(lián)合口服維甲酸(ATRA)已經(jīng)成為初治非高危型APL的標準治療方案。ATO也開始在其他惡性血液病領域有進一步的研究觀察。然而，在MCL中ATO的相關研究報道甚少。
　　DNA甲基

6、化是目前腫瘤研究中的熱點之一，大量研究表明腫瘤發(fā)生發(fā)展中存在抑癌基因甲基化水平和模式的調(diào)控紊亂。由于DNA甲基化為可逆性調(diào)控，因此可以作為腫瘤靶向治療的重要研究調(diào)控方向。在胃腸道腫瘤及部分淋巴瘤中均有發(fā)現(xiàn)KLF4啟動子區(qū)域因甲基化而導致的基因沉默，提示KLF4啟動子甲基化可能與腫瘤發(fā)生進展密切相關。
　　本研究應用細胞生物學、分子生物學、免疫學及慢病毒轉(zhuǎn)染介導基因過表達等技術(shù)，探討了KLF4與ATO通過調(diào)控Wnt信號通路在MCL疾

7、病發(fā)生發(fā)展中的調(diào)控作用及機制，為尋求新的分子標志物和靶向治療提供分子生物學依據(jù)。
　　第一部分:KLF4在套細胞淋巴瘤中調(diào)控機制研究
　　目的:
　　KLF4為鋅指蛋白類核轉(zhuǎn)錄因子，是多能干細胞(iPS)的誘導因子之一，可在不同腫瘤中與不同的靶基因相互作用發(fā)揮抑癌或促癌作用。KLF4隨B細胞成熟度增高而表達升高，在多種血液腫瘤中發(fā)現(xiàn)表達減低、缺失。有研究表明KLF4在血液惡性疾病中的作用仍存在爭議。套細胞淋巴瘤來源于淋

8、巴結(jié)濾泡外套B細胞異常增殖，發(fā)展迅速，屬侵襲性淋巴瘤，預后不佳，因此積極探索疾病發(fā)病機制，尋找腫瘤標志物和有效靶向治療成為最具潛力的突破方向。本研究旨在探討KLF4在套細胞淋巴瘤中表達及其影響因素，及對Wnt信號通路的調(diào)控和機制。
　　方法:
　　1.細胞培養(yǎng)和切片組織標本收集;
　　2.RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄和實時定量PCR;
　　3.免疫組織化學染色;
　　4.蛋白提取和western blot分析;

9、>　　5.慢病毒載體轉(zhuǎn)染介導MCL細胞株KLF4過表達;
　　6.流式細胞儀檢測細胞凋亡，CCK8法檢測細胞增殖;;
　　7.免疫沉淀(IP)法檢測KLF4與β-catenin結(jié)合情況;
　　8.統(tǒng)計學分析。
　　結(jié)果:
　　1.通過實時定量PCR、western blot結(jié)果分析，與健康志愿者相比較，套細胞淋巴瘤細胞株（Jeko-1，Mino，SP53）中KLF4 mRNA、蛋白表達均明顯減低。免疫組化分

10、析顯示套細胞淋巴瘤患者淋巴瘤組織石蠟標本中KLF4表達水平均減低，且其表達水平與套細胞淋巴瘤患者分期密切相關(P＜0.05)。
　　2.通過western blot結(jié)果分析，套細胞淋巴瘤細胞株Jeko-1，Mino，SP53中β-catenin、c-myc、cyclin D1的蛋白表達與健康志愿者相比明顯升高。免疫組化結(jié)果分析套細胞淋巴瘤患者淋巴瘤組織標本中KLF4表達水平與β-catenin表達水平相關(P＜0.05)。

11、　　3.流式細胞儀檢測分析顯示，慢病毒介導過表達KLF4的Jeko-1細胞凋亡增加，CCK8法檢測KLF4過表達Jeko-1細胞增殖受抑制，上述細胞株中β-catenin、c-myc表達下調(diào)，IP結(jié)果表明KLF4與β-catenin發(fā)生了蛋白結(jié)合。
　　4.通過western blot、免疫組化結(jié)果分析，套細胞淋巴瘤細胞株(Jeko-1，Mino，SP53)以及套細胞淋巴瘤患者淋巴瘤組織石蠟標本中DNMT-1表達水平與正常對照標本

12、相比均增高。去甲基化藥物5-azaC處理Jeko-1，Mino細胞后，去甲基化轉(zhuǎn)移酶-1(DNMT-1)表達受抑制，而KLF4表達水平升高，Wnt/β-catenin通路分子表達受抑制。
　　結(jié)論:
　　本研究表明KLF4在套細胞淋巴瘤中的表達水平與患者疾病分期密切相關，KLF4過表達可抑制β-catenin及其下游分子cyclinD1，c-myc的表達，通過免疫沉淀的研究證明KLF4表達增高后與β-catenin結(jié)合，使其

13、不能進一步激活下游通路，是其發(fā)揮抑癌作用的機制之一。DNMT-1在套細胞淋巴瘤組織及細胞株內(nèi)高表達，去甲基化藥物可促使KLF4恢復表達，且抑制Wnt通路相關分子，說明KLF4基因在套細胞淋巴瘤中可能因基因甲基化沉默。KLF4的表達水平、原因分析及作用機制研究對探索套細胞淋巴瘤的致病機制有重要意義。
　　第二部分:亞砷酸在套細胞淋巴瘤中通過調(diào)控Wnt/β-catenin通路和DNMT-1發(fā)揮抗腫瘤作用的機制研究
　　目的:

14、r>　　亞砷酸(ATO)已成為治療急性早幼粒白血病標準方案藥物之一，并在其它惡性血液病領域也有進一步的探討研究。套細胞淋巴瘤是淋巴結(jié)濾泡外套B細胞異常增殖起源的非霍奇金淋巴瘤，病情進展迅速，屬侵襲性淋巴瘤，預后不佳，因此積極探索疾病發(fā)病機制，尋找有效的抗腫瘤藥物成為重點研究方向。本研究旨在評估ATO在套細胞淋巴瘤中的抗腫瘤作用及并進一步研究ATO相關作用的分子生物學機制。
　　方法:
　　1.細胞培養(yǎng)和切片組織標本收集;

15、r>　　2.免疫組織化學染色;
　　3.蛋白提取和western blot分析;
　　4.RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄和實時定量PCR;
　　5.ATO、5-azaC、LiCl按照所需藥物濃度處理培養(yǎng)細胞;
　　6.流式細胞儀檢測細胞凋亡;
　　7.統(tǒng)計學分析。
　　結(jié)果:
　　1.CCK8檢測及流式分析結(jié)果顯示ATO對套細胞淋巴瘤細胞株Jeko-1，Mino有顯著的抑制增殖和促進凋亡作用，效果隨藥物濃度

16、升高更顯著。
　　2.通過western blot、免疫組化結(jié)果分析，套細胞淋巴瘤細胞株(Jeko-1，Mino，SP53、Grant519)中β-catenin、c-myc、DNMT-1的蛋白表達與健康志愿者相比較均明顯上調(diào)(P＜0.05)。生存分析顯示DNMT-1陽性表達的套細胞淋巴瘤患者在39個月前的生存率明顯低于陰性患者。
　　3.不同濃度ATO處理套細胞淋巴瘤細胞株(Jeko-1，Mino，SP53)后，weste

17、rn blot及實時定量PCR分析顯示ATO可抑制細胞中DNMT-1和Wnt通路中β-catenin、及下游分子c-myc、cyclin D1、MMP7的表達，且抑制作用有劑量依賴性。
　　4.Western blot結(jié)果分析顯示ATO可以抑制由套細胞淋巴瘤細胞株細胞中LiCl刺激引起的β-catenin升高，并與5-azaC對DNMT-1的抑制有協(xié)同作用。
　　結(jié)論:
　　本研究表明ATO在套細胞淋巴瘤中發(fā)揮腫瘤抑制