小麥全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)構(gòu)建、測(cè)序與分析.pdf

1、本文在引進(jìn)、消化吸收的基礎(chǔ)上，對(duì)Cap-trapper法做了進(jìn)一步的改進(jìn)，形成了一套簡(jiǎn)單易行的技術(shù)體系，建立了全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)構(gòu)建技術(shù)平臺(tái)。利用改進(jìn)的Cap-trapper法，分別構(gòu)建了不同倍性、不同組織、不同處理的小麥全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)10個(gè)，涉及普通小麥(AABBDD)及其三個(gè)二倍體祖先種(AA、SS和DD)和四倍體波斯小麥(AABB)共計(jì)小麥的5個(gè)種，涉及幼苗、根、愈傷組織、花藥、胚乳，并設(shè)有白粉菌誘導(dǎo)誘導(dǎo)與對(duì)照等。所建文庫(kù)插入片段

2、平均為1.5kb左右，原始文庫(kù)的庫(kù)容量在6.0×105～5.0×106pfu之間，經(jīng)后期測(cè)序并與GenBank公布的小麥全長(zhǎng)mRNA序列比對(duì)分析表明克隆的全長(zhǎng)比例為93％左右，擴(kuò)增文庫(kù)滴度在1010pfu/ml數(shù)量級(jí)，適合于大規(guī)模測(cè)序需要，是開(kāi)展小麥功能基因?qū)W研究的寶貴資源。 試驗(yàn)從10個(gè)全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)隨機(jī)挑取大約11萬(wàn)個(gè)克隆進(jìn)行3’端測(cè)序，獲得106,671條3’端EST，去除冗余后選擇代表性克隆進(jìn)行了克隆5’端測(cè)序，獲得3

3、1,732條5'EST，共獲得138,403條EST，得到高質(zhì)量序列(Q20)數(shù)據(jù)7.46×107bp。在去除ployA和短于100bp的序列后獲得5'EST和3'EST分別為30,586條和95,736條。經(jīng)cap3軟件聚類分析表明試驗(yàn)獲得了32,899條不重復(fù)克隆。 GC含量統(tǒng)計(jì)表明小麥族基因cDNA序列中GC含量為54.0％，這與水稻基因組GC含量基本一致(53.4％)，而與擬南芥有明顯差別(40.7％)；5’和3’EST

4、比較發(fā)現(xiàn)5’端GC含量為57.80％，明顯高于3’的GC含量(52.8％)。推測(cè)小麥基因的這種高GC含量特別是5’端高GC含量是小麥全長(zhǎng)基因克隆和測(cè)序困難的原因之一。 將獲得的32,899條不重復(fù)序列使用blast軟件將比對(duì)參數(shù)E值設(shè)為1e-20對(duì)879,695條小麥公共EST數(shù)據(jù)進(jìn)行相似性搜索，結(jié)果表明8,800條為新的小麥EST(26.75％)；使用參數(shù)1e-5對(duì)水稻32,127條全長(zhǎng)cDNA序列比對(duì)結(jié)果表明15,992條(

5、48.6％)序列在水稻全長(zhǎng)cDNA中沒(méi)有對(duì)應(yīng)序列。同時(shí)，利用1e-20的參數(shù)對(duì)水稻1,191,102條水稻EST數(shù)據(jù)blast結(jié)果表明18,672條沒(méi)有相應(yīng)序列(56.75％)；用該數(shù)據(jù)集對(duì)華大基因組研究所測(cè)序的水稻基因組序列blastn搜索結(jié)果表明14,382條(43.72％)在水稻基因組序列中沒(méi)有對(duì)應(yīng)序列(E-value1e-5)。 密碼子使用的偏愛(ài)性是生物在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中逐漸形成的，影響偏愛(ài)性的因素有多種，如G+C含量，基

6、因表達(dá)水平，基因的長(zhǎng)度，tRNA的豐度等等。我們隨機(jī)挑取了750條全長(zhǎng)序列使用codonW軟件對(duì)小麥密碼子使用偏愛(ài)性進(jìn)行了分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明小麥基因密碼子第三位GC含量為54％左右，與表達(dá)基因的整體GC含量一致；同時(shí)發(fā)現(xiàn)小麥優(yōu)先使用的密碼子27個(gè)，所有優(yōu)先使用的密碼子均以G或者C結(jié)尾，無(wú)一例外，這與水稻的情況非常一致；而擬南芥為低GC含量物種，僅為44％，所有優(yōu)先使用的密碼子均以A或者T結(jié)尾。說(shuō)明植物進(jìn)化過(guò)程中單雙子葉植物分開(kāi)后首先GC

7、含量趨異非常明顯，進(jìn)而密碼子優(yōu)先使用特性也完全不同。 使用基于Linux平臺(tái)的本地化分析平臺(tái)系統(tǒng)對(duì)獲得32,899條序列進(jìn)行了分子功能、生物過(guò)程和細(xì)胞組分三個(gè)層次的GeneOntology注釋，獲得了小麥基因的多層次注釋信息。 使用GO-Diff軟件，基于GO分類信息和基因表達(dá)譜信息對(duì)來(lái)自粗山羊草根和葉兩種組織全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)的EST進(jìn)行文庫(kù)間基因表達(dá)差異分析，發(fā)現(xiàn)了許多組織間表達(dá)差異顯著的基因和一些組織特異性的基因。比

8、如下面的16個(gè)基因只在根中檢測(cè)到有表達(dá)，分別是4-香豆酸輔酶A接合酶(4-coumarate-CoAligase)、酸硫醇連接酶(acid-thiolligase)、腺苷高半胱氨酸酶(adenosylhomocysteinase)、β葡糖苷酶(beta-glucosidase0)、纖維素酶(cellulase)、輔酶A連接酶(CoA-ligase)、γ谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(gamma-glutamyltransferase)、谷氨酰胺－果糖－6

9、－磷酸氨基轉(zhuǎn)移酶(glutamine-fructose-6-phosphatetransaminase(isomerizing))、醚水解酶(hydrolaseactivity，actingonetherbonds)、分子內(nèi)氧化還原酶(催化分子內(nèi)酮式－乙醇式轉(zhuǎn)換)(intramolecularoxidoreductase，interconvertingketo-andenol-groups)、分子內(nèi)氧化還原酶(置換二硫鍵)(intram

10、olecularoxidoreductaseactivity，transposingS-Sbonds)煙酰胺合成酶(nicotianaminesynthase)、6－磷酸葡萄糖酸脫氫酶(phosphogluconatedehydrogenase(decarboxylating))、脯氨酸脫氫酶(prolinedehydrogenase)、蛋白二硫異構(gòu)酶(proteindisulfideisomerase)和三烷基磺酰脫氫酶(trialk

11、ylsulfoniumhydrolase)；而僅在葉組織中檢測(cè)到高表達(dá)的基因?yàn)檠趸€原酶(oxidoreductase)、碳酸鹽脫水酶(carbonatedehydratases)、鎂原卟啉Ⅸ單甲酯環(huán)化酶(magnesium-protoporphyrinⅨmonomethylester(oxidative)cyclases)、原葉綠素酸酯還原酶(protochlorophyllidereductase)、絲氨酸酯酶(serineeste

12、rase)、羧酸酯酶(carboxylesterase)、甘油醛3磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase)等。同時(shí)，將公共數(shù)據(jù)庫(kù)GenBank公布的中國(guó)春小麥可育花藥EST的34,615條與我們構(gòu)建的矮敗中國(guó)春花藥幼穗混合庫(kù)測(cè)序獲得的33051條EST比較分析也獲得了組織特異性表達(dá)的基因。這種基于大規(guī)模測(cè)序并挖掘背景相同育性不同材料中表達(dá)基因的差異將為小麥雄性不育的分子機(jī)理研究提供了基