梅毒螺旋體寡核苷酸芯片的研制.pdf

1、梅毒是由梅毒螺旋體(又稱蒼白螺旋體Treponema pallidum,Tp)感染引起的一種全球分布的性傳播病,與HIV感染和傳播有密切的關(guān)系。梅毒在許多發(fā)展中國(guó)家高度流行,在發(fā)達(dá)國(guó)家社會(huì)經(jīng)濟(jì)地位較低人群中仍為一重要的公共衛(wèi)生問題。近年來(lái)在我國(guó)梅毒的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。目前梅毒血清學(xué)檢驗(yàn)已列入獻(xiàn)血員和臨床患者輸血前、手術(shù)前以及各種創(chuàng)傷性檢查前的常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目。長(zhǎng)期以來(lái),由于梅毒螺旋體在體外不能人工培養(yǎng),故在實(shí)驗(yàn)室難以對(duì)其進(jìn)行研究,迄今尚

2、無(wú)高效的診斷、鑒別診斷方法以及征服該病的疫苗。因此研究新的快速、簡(jiǎn)便、敏感且特異的診斷方法,尤其是迫切需要發(fā)展針對(duì)感染梅毒后兩周、先天梅毒和神經(jīng)梅毒的診斷方法,對(duì)該病的早期診斷、早期治療有著重要的意義。
　　 傳統(tǒng)的梅毒檢測(cè)手段主要有梅毒病原體檢測(cè)法、血清抗體檢測(cè)法、PCR法等,而目前國(guó)內(nèi)外主要采用血清學(xué)快速檢測(cè)方法,以非特異抗體檢測(cè)法為初篩,再以特異梅毒螺旋體抗體檢測(cè)作為確證試驗(yàn)。但這些傳統(tǒng)的檢測(cè)方法一次只能確定或排除一種病原

3、體,不能實(shí)現(xiàn)大規(guī)模高通量的檢測(cè)。另一方面,由于人體對(duì)外來(lái)病原體產(chǎn)生免疫有一定的時(shí)滯,這些血清學(xué)檢測(cè)方法對(duì)檢測(cè)梅毒初染階段、先天梅毒敏感性很低?；蛐酒夹g(shù)為梅毒螺旋體的檢測(cè)提供一種新的途徑?；蛐酒瑱z測(cè)的對(duì)象是DNA或RNA,只要人體內(nèi)有病原的核酸就能檢出,并能同時(shí)對(duì)多種病原體進(jìn)行檢測(cè),具有明顯的優(yōu)越性。
　　 基因芯片技術(shù)根據(jù)探針類型分為cDNA芯片和寡核苷酸芯片,近年來(lái)的研究表明,寡核苷酸芯片比cDNA芯片有著更高的特異性,

4、同時(shí)其靈敏度也能滿足目前病原體檢測(cè)的要求。寡核苷酸芯片的制作既可以采用芯片上原位合成短的寡核苷酸探針的方法,也可以采用合成儀人工合成15～80mer的寡核苷酸探針然后固定在支持物上的方法制備。這兩種方法中,后者相對(duì)簡(jiǎn)單易行,且系統(tǒng)的開放性較好。而在探針的長(zhǎng)度的選擇上,50～70mer的寡核苷酸探針被認(rèn)為能取得特異性和靈敏度之間的平衡,并且多數(shù)情況下只需一個(gè)探針即可檢測(cè)一個(gè)基因。
　　 基因芯片具有快速、高效、平行化檢測(cè)的特點(diǎn),因

5、此在基因表達(dá)譜的基礎(chǔ)研究和病原體檢測(cè)、疾病診斷上的應(yīng)用研究方面已得到廣泛應(yīng)用。然而基因芯片的臨床應(yīng)用仍然面臨很多需要解決的問題,其中芯片的質(zhì)量控制是一個(gè)關(guān)鍵問題,此外多種芯片技術(shù)平臺(tái)得到的研究結(jié)果不一致等。
　　 本課題第一部分提出一種新的芯片質(zhì)控方法:即在探針設(shè)計(jì)中引入一段特異的通用引物互補(bǔ)序列,以Cy3或Cy5標(biāo)記的通用引物與該芯片雜交,達(dá)到檢測(cè)芯片制備質(zhì)量的目的。這部分實(shí)驗(yàn)首先在本實(shí)驗(yàn)室前期cDNA芯片實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行:以

6、HIV-1的4個(gè)亞型(B、C、F、G)質(zhì)粒:HIV1U26942、C2220、FIN9363、HH8793為模型。在cDNA芯片探針的制備中采用限制性顯示(RD-PCR)技術(shù),以Sau3A Ⅰ酶切HIV基因,得到若干限制性酶切片段,然后在片段兩端接上接頭(通用引物UP1互補(bǔ)序列),根據(jù)酶切位點(diǎn)、接頭的序列設(shè)計(jì)通用引物,并在通用引物的3’端延伸一個(gè)堿基,以此引物進(jìn)行PCR反應(yīng),不僅可以分別擴(kuò)增若干組片段,而且可以保證每一組探針片段的兩端都

7、有一段公共序列。以上述限制性基因探針制備芯片,以Cy3標(biāo)記的通用引物(Cy3-UP1)與芯片雜交,對(duì)照樣品為Cy3標(biāo)記的隨機(jī)引物(Cy3-RP),比較兩者雜交效率。結(jié)果:熒光標(biāo)記的通用引物雜交結(jié)果顯著優(yōu)于熒光標(biāo)記的隨機(jī)引物雜交結(jié)果,在較低濃度就可顯示較強(qiáng)的熒光信號(hào)(大約相差10倍濃度級(jí))。結(jié)果表明,對(duì)于不同的探針,都可以通過檢測(cè)兩端公共序列的信息來(lái)代表整個(gè)探針的信息,從而達(dá)到檢測(cè)芯片制備質(zhì)量的目的。
　　 進(jìn)一步,本課題根據(jù)上述

8、思路,設(shè)計(jì)了一種新型寡核苷酸芯片探針:即在50 mer或60 mer靶基因寡核苷酸的一端或兩端引入一段公共序列(即連接臂,通用引物UP2互補(bǔ)序列的一部分)。實(shí)驗(yàn)中,以HIV基因靶基因,設(shè)計(jì)了14條連接有不同序列及不同連接方式連接臂的寡核苷酸探針,通過Cy5標(biāo)記的通用引物(Cy5-UP2)與上述新型寡核苷酸探針制備的芯片雜交,篩選出5條信號(hào)強(qiáng)而穩(wěn)定的探針,其中8號(hào)探針雜交信號(hào)最強(qiáng),為最佳質(zhì)控寡核苷酸探針設(shè)計(jì)方式。然后,再以篩選出來(lái)的5種新

9、型探針制備芯片,與不同濃度梯度的Cy5標(biāo)記通用引物(Cy5-UP2)和隨機(jī)引物(Cy5-RP)雜交。結(jié)果:20μmol/L、2μmol/L的Cy5-UP2與芯片雜交全部探針雜交出現(xiàn)較強(qiáng)的信號(hào),0.2μmol/L的Cy5-UP2與芯片雜交部分探針也有雜交信號(hào),尤其是8號(hào)探針。而2μmol/L、0.2μmol/L的Cy5-RP與芯片雜交基本沒有信號(hào)。兩者熒光信號(hào)強(qiáng)度值相比,20μmol/L的Cy5-UP2與芯片雜交信號(hào)比20μmol/L的C

10、y5-RP與芯片雜交信號(hào)明顯強(qiáng)。結(jié)果進(jìn)一步證實(shí):通過檢測(cè)寡核苷酸探針中公共序列來(lái)實(shí)現(xiàn)芯片質(zhì)控的方法是可行且高效的。
　　 在上述基礎(chǔ)上,本課題的第二部分,以梅毒螺旋體基因?yàn)閷?duì)象,利用上述設(shè)計(jì)方法設(shè)計(jì)梅毒螺旋體寡核苷酸探針,開展梅毒螺旋體寡核苷酸芯片研制的初步研究。
　　 梅毒螺旋體為蒼白密螺旋體蒼白亞種,1998年公布的梅毒螺旋體Nichols株全基因組序列有1.138Mb,平均G+C含量為52.8％,有1041個(gè)預(yù)測(cè)的

11、開放閱讀框架,平均大小為1023bp,代表92.9％的總基因組DNA。梅毒螺旋體基因組與其它密螺旋體(如雅司螺旋體、地方性梅毒密螺旋體)的同源性超過95％,與伯氏疏螺旋體基因組比較,其中476個(gè)開放閱讀框架(46％)有進(jìn)化同源性。梅毒螺旋體基因分型采用Pillay等人應(yīng)用PCR及限制性片段長(zhǎng)度的多態(tài)性方法建立的用arp基因與tpr基因二個(gè)系統(tǒng)聯(lián)合對(duì)Tp進(jìn)行分了分型的方法,據(jù)國(guó)內(nèi)外報(bào)道其主要的優(yōu)勢(shì)流行株是14D亞型。
　　 本實(shí)驗(yàn)

12、首先在NCBI GenBank中獲取梅毒螺旋體尼克爾斯株的全基因組序列(GenBank登陸號(hào)NC 000919),通過文獻(xiàn)檢索及BLAST分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)Pol-A基因、TP47膜蛋白基因(tpp47基因)、Tp92膜蛋白基因(Tp92基因)、Tp15KD脂蛋白基因(tpp15基因)的部分序列為梅毒螺旋體的保守序列,其中PolA和Tpp47具有蒼白螺旋體亞種特異性、TP92和Tpp15有密螺旋體屬的特異性。使用生物學(xué)軟件Oligo6.0分別

13、對(duì)BLAST分析所得特異性序列進(jìn)行逐一分析,設(shè)計(jì)長(zhǎng)度均一、各種參數(shù)適合的38條長(zhǎng)度為50mer的寡核苷酸探針。將其中1、2、7號(hào)探針兩端加10mer的連接臂(相同于第一章8號(hào)寡核苷酸探針)形成具有檢測(cè)梅毒螺旋體基因芯片制備質(zhì)量的寡核苷酸探針(即質(zhì)控探針)。實(shí)驗(yàn)采用Tpp47、Pol-A基因的23條探針(包括3條質(zhì)控探針)為實(shí)驗(yàn)探針,固定在環(huán)氧基化的玻片上制備芯片。
　　 本課題獲得梅毒螺旋體Nichols株的DNA,擴(kuò)增梅毒螺旋

14、體DNA的Pol-A、Tpp47、TP92和。Tpp15基因后克隆至pMD18-T載體,然后測(cè)序鑒定。這些基因片段作為梅毒螺旋體芯片的陽(yáng)性樣品,用以篩選梅毒螺旋體寡核苷酸探針。
　　 進(jìn)一步,以梅毒螺旋體的PolA和Tpp47基因片段為陽(yáng)性樣品,用本實(shí)驗(yàn)室的專利技術(shù)--通用引物聯(lián)合標(biāo)記法進(jìn)行Cy3熒光標(biāo)記。用Cy5-UP2和Cy3標(biāo)記的樣品混合液與芯片進(jìn)行雙色雜交,掃描后獲得的兩種通道的熒光信號(hào)值。前者(即紅色)為Cy5-UP2

15、雜交信號(hào),用來(lái)檢測(cè)TP芯片的制備質(zhì)量；后者(即綠色)為梅毒螺旋體的樣品雜交信號(hào),用來(lái)篩選特異性的梅毒螺旋體陽(yáng)性探針。芯片雜交結(jié)果顯示,檢測(cè)芯片的質(zhì)控有效,大部分探針都有雜交信號(hào)。根據(jù)熒光強(qiáng)度信號(hào)值、信噪比篩選出符合要求的敏感性和特異性較高的9條探針,即1、3、7、8、9、11、13、14、16、20和21號(hào)探針。利用篩選的探針建立了梅毒螺旋體基因檢測(cè)芯片系統(tǒng)。
　　 綜上所述,本研究結(jié)合新型探針設(shè)計(jì),探索了一種方便的、有效的檢測(cè)