廣州市A型流感病毒的遺傳進化研究.pdf

1、研究背景和目的 流行性感冒(Influenza)簡稱流感，是由人流感病毒引起的危害人類健康的常見急性傳染病。在每年流感的季節(jié)性流行期內(nèi)，流感病毒可以在短時間內(nèi)在全球范圍內(nèi)傳播，可造成世界上10％～20％的人口受到影響，300～500萬嚴重病例，25～50萬人死亡。因此對流感病毒進行長期的、全球范圍的監(jiān)測，以及對其預(yù)防控制就顯得十分必要。我國從1952開始進行流感病毒研究，1981年加入WHO的流感監(jiān)測網(wǎng)，自2000年以來，與WH

2、O合作，在全國31個省(市)和自治區(qū)開展流感監(jiān)測。廣東地區(qū)從1971年以來開展了全省流感監(jiān)測，1988年廣東地區(qū)按照WHO的規(guī)劃，建立全省流感監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)。廣州作為華南地區(qū)重要的城市之一，人口密集，人員流動頻繁，與港澳及國際交往頻繁，是流感的多發(fā)地。因此對廣州流感流行的監(jiān)測，以及對流感病毒分子進化的動態(tài)研究是十分必要且有意義的一項工作。 2006年廣州市流感活動頻繁，小規(guī)模暴發(fā)了13起H1N1亞型流感疫情，這是該亞型病毒在廣州市沉寂

3、了4年后的再次流行，在隨后的2007年又基本上銷聲匿跡，全年只分離到1株。為了解2006年廣州市流感流行的基本狀況，探究2006年和2007年廣州H1N1亞型病毒的遺傳和進化規(guī)律，本研究挑選出45株代表株，應(yīng)用血清學(xué)、分子生物學(xué)及生物信息學(xué)的方法，鑒定了病毒的型別、擴增和克隆了H1N1亞型流感病毒HA和NA基因，并對序列進行了全面的分析比對。 方法 應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)的方法，挑選了45株病毒作為代表株，并在MDCK細胞中進行分離

4、培養(yǎng)；通過血凝和血凝抑制試驗、RT-PCR．法對病毒進行鑒定分型；運用RT-PCR的方法擴增全部毒株的全長HA基因，和7株病毒(包括暴發(fā)期的5株和散發(fā)期的2株)的全長NA基因，建立了T-A克隆并測序。測序結(jié)果應(yīng)用DNAStar軟件包中EditSeq進行編輯和拼接，并推導(dǎo)出氨基酸序列。 從NCBI流感病毒基因組數(shù)據(jù)庫下載2005年～2008年亞洲地區(qū)各宿主中分離的H1N1亞型流感病毒的HA和NA基因ORF序列和氨基酸序列。用Clu

5、stal X軟件對HA和NA基因ORF序列進行比對，MEGA3.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。用DNAStar軟件包中的MegAlign程序?qū)Π被嵝蛄羞M行比對，計算各毒株與疫苗株的同源性，并在3D-JIGSAW蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫對兩株病毒的HA蛋白空間結(jié)構(gòu)進行在線預(yù)測，分析其氨基酸的改變對蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的可能影響。 結(jié)果 1、在MDCK細胞中成功培養(yǎng)出45株病毒，經(jīng)鑒定分型，其中21株為B型，24株為H1N1亞型，無H3N2亞型

6、。發(fā)病人群集中在中、小學(xué)校，特別是小學(xué)校，H1N1亞型主要發(fā)生在大學(xué)里。2006年流感流行季節(jié)內(nèi)出現(xiàn)優(yōu)勢流行株的交替，3月和4月以B型為主，5月份病例數(shù)較前兩個月明顯減少，到了6月，H1N1亞型病毒在大學(xué)城出現(xiàn)小規(guī)模暴發(fā)，6月下旬病例數(shù)到達頂峰，7月份疫情得到控制，病例數(shù)明顯下降。 2、H1N1亞型病毒的血凝抑制效價與用標準抗原和標準抗體作的血凝抑制效價(1：320)相仿，均未低于4倍效價，說明抗原變異幅度不大。 3、2

7、4個H1N1亞型毒株的HA基因全長，除毒株44在1759位插入一個堿基A為1776bp，余均為1775bp，ORF序列長度均為1698bp，均由566個aa組成。NA基因全長，除506在14位缺失一個堿基為1461bp，其它6株均為1462bp，ORF序列長為1413bp，氨基酸序列長度為471aa。 4、從HA-ORF和NA-ORF的遺傳和進化分析中可以看出，大部分毒株有明顯的時間分化特點，即同一年分離到的毒株同源性相對較高，

8、如果是同一年同一國家的病毒株則同源性最高。24個分離株中有23株的HA基因和7個分離株的NA基因同源性較高，只有44號分離株的HA基因與其它HA基因的進化關(guān)系較遠，與2005年從其它國家分離的毒株關(guān)系較近。44號分離株與2006～2007年疫苗株New Caledonia／20／1999株進化關(guān)系較近，而其它分離株都與2007～2008年疫苗株Solomon Islands／3／2006株進化關(guān)系較近。 5、24株分離株中有20

9、株在HA蛋白Sb抗原區(qū)205位和206位同時發(fā)生了變異，206位均是A-T變異，205位有15株是R-M變異、2株是R-N變異、3株是R-S變異。在205位發(fā)生R-S變異的3株在Ca1抗原區(qū)的183位和187位，還分別發(fā)生了A-E和E-K的變異。在暴發(fā)期分離的506株，除了在205位和206位分別發(fā)生R-M和A-T的變異外，還在Sb抗原區(qū)170位還發(fā)生了G-R變異。計算與兩個疫苗株HA蛋白氨基酸序列的同源性發(fā)現(xiàn)，與Solomon Isl

10、ands／3／2006株的同源性略高于與New Caledonia／20／1999株的同源性。對HA蛋白3-D空間結(jié)構(gòu)分析還發(fā)現(xiàn)205位和206位的改變引起受體結(jié)合位點結(jié)構(gòu)的微小變化。有22個分離株的HA蛋白有10個潛在糖基化位點，1561株有9個和657株11個。HAO分割位點無變異。 6、7個分離株中的5個毒株的NA蛋白在344位(抗原區(qū)4)和367位(抗原區(qū)5)分別發(fā)生D-N和L-I的變異，506號分離株同時還在398位(

11、抗原區(qū)6)發(fā)生了D-N的變異。所有的唾液酸結(jié)合位點都沒有發(fā)現(xiàn)變異。其中5個毒株有7個潛在糖基化位點，506號分離株有8個。 結(jié)論 1、2006年廣州市流感流行高峰在3～6月份，H1N1亞型、B型交替成為優(yōu)勢流行株，未分離到H3N2亞型。 2、2006～2007年H1N1亞型流感病毒在HA蛋白的抗原區(qū)、受體結(jié)合位點、潛在糖基化位點和NA蛋白的抗原區(qū)發(fā)生了點突變，這很有可能是引起該亞型流感病毒再次暴發(fā)的原因之一。