RNA干擾沉默乙肝病毒X基因表達實驗性治療肝細胞癌的研究.pdf

1、中南大學博士學位論文RNA干擾沉默乙肝病毒X基因表達實驗性治療肝細胞癌的研究姓名：王文龍申請學位級別：博士專業(yè)：內(nèi)科學指導(dǎo)教師：楊旭20080601博士學位論文英文摘要細胞，觀察EGFP表達，流式細胞分析轉(zhuǎn)染效率。電穿孔轉(zhuǎn)染將三種構(gòu)建的質(zhì)粒導(dǎo)入MHCC97H細胞；G418篩選、挑單細胞克?。挥冒攵縍TPCR及細胞免疫熒光分析單細胞克隆中靶[句shRNA對HBx基因mRNA及細胞內(nèi)船x蛋白水平的影響。對HBx表達下調(diào)的單細胞克隆，體外實

2、驗分析細胞周期、細胞增殖；裸鼠體內(nèi)單細胞克隆成瘤情況：并對成瘤組織行病理分析。結(jié)果：在MHCC97一H細胞中克隆、測序獲247bpHBx基因片段，Blast分析證實整合的HBx基因為adr亞型(C基因型)；HBx全基因擴增失敗，推測船VDNA整合位點可能位于HBx基因3’末端，導(dǎo)致整合HBx基因3’末端缺失；MHCC97一H細胞整合HBx基因轉(zhuǎn)錄mRNA并表達HBx蛋白。酶切、PCR及測序證實pshRNAX164／X215／MOCK載體

3、構(gòu)建成功；轉(zhuǎn)染48h后MHCC97H細胞發(fā)出綠色熒光，pshRNhX215轉(zhuǎn)染效率最低。經(jīng)過30一35天篩選，pshRNAX215／X164／MOCK質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后分別挑取了109個、184、60個單細胞克??；半定量RTPCR分析：與姍ICC97H比較，MOCK各單細胞克隆HBxmRNA水平變化不明顯；與MOCK02克隆比較，X215有6個克隆有HBxmRNA水平的下調(diào)約為70—93％，X164各克隆下調(diào)≤25％；與MOCK02克隆比較，2