人胸膜間皮細胞水通道蛋白的表達及其調(diào)控.pdf

1、本課題為研究間皮細胞在胸腔內(nèi)液體轉(zhuǎn)運中的作用，分離培養(yǎng)原代胸膜間皮細胞，研究其在體外培養(yǎng)時的生物學特性；并對不同標本來源的間皮細胞進行對比．以原代間皮細胞為研究對象檢測其水通道蛋白mRNA的表達及調(diào)控．對于認識間皮細胞的功能及探討胸膜腔內(nèi)液體的轉(zhuǎn)運機理有重要價值． 實驗材料與方法： 一、胸膜間皮細胞的分離與培養(yǎng)。利用兩種取材方法建立人胸膜間皮細胞(HPMC)體外培養(yǎng)模型，一是用胰蛋白酶-EDTA消化法，從人肺臟胸膜及壁胸

2、膜上分離胸膜間皮細胞：二是從胸腔積液中分離胸膜間皮細胞；進行胸膜間皮細胞的體外培養(yǎng)．用形態(tài)學和免疫細胞化學方法對培養(yǎng)所得細胞進行鑒定． 二、胸膜間皮細胞水通蛋白1～10mRNA表達的檢測。利用體外培養(yǎng)的原代人胸膜間皮細胞，檢測人胸膜間皮細胞水通道蛋白1～10mRNA的表達，用RT-PCR(reverse transaiption polyrmrease chain reaction)檢測水通道蛋白1～10(AQP<,1～10>)

3、mRNA在人胸膜間皮細胞上的表達． 三、地塞米松對人胸膜間皮細胞水通道蛋白1 mRNA表達的影響。臟層與壁層胸膜組織標本，應用免疫組織化學染色方法檢測其AQP<,1>蛋白水平的表達；體外培養(yǎng)的人胸膜間皮細胞，給于糖皮質(zhì)激素(地塞米松)和糖皮質(zhì)激素受體阻斷劑(RU486)干預，研究地塞米松對人胸膜間皮細胞AQP<,1>mRNA表達的影響．用RT-PCR檢測人胸膜間皮細胞上AQP<,1> mRNA的表達情況．實驗分三組：地塞米松組；

4、地塞米松+RU486；對照組．分別給于不同濃度的藥物，作用不同時間，檢測不同組人胸膜間皮細胞AQP<,1> mRNA表達的差異． 研究結(jié)果： 一、細胞的分離與培養(yǎng)。倒置顯微鏡下可見細胞匯合后呈多角形鋪路石樣，電鏡下可見豐富的微絨毛和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，免疫細胞化學染色結(jié)果顯示角蛋白、波形蛋白表達陽性，抗Ⅷ因子相關(guān)單克隆抗體、抗人白細胞CD<,45>表達陰性；排除了成纖維細胞、白細胞及內(nèi)皮細胞的可能性：證實為人的胸膜間皮細胞．兩種方法

5、得到的細胞純度均在98％以上：具有較好的細胞活力．兩種取材方法均可以成功建立間皮細胞體外培養(yǎng)模型，方法學上均有可行性． 二、水通蛋白1～10 mRNA表達。人胸膜間皮細胞上AQP<,1～10>mRNA均有表達，AQP<,1>、AQP<,9>、AQP<,10>表達豐富.結(jié)合已知它們的功能，證實人胸膜間皮細胞參于胸腔內(nèi)液體轉(zhuǎn)運用其它小分子物質(zhì)的轉(zhuǎn)運． 三、地塞米松干預實驗。人臟層胸膜與壁層胸膜間皮細胞上均存在AQP<,1>蛋

6、白的表達，且胸膜下血管內(nèi)皮與紅細胞上也存在AQP<,1>蛋白的表達；地塞米松可以增加AQP<,1> mRNA的表達，且有劑量依賴性特點，干預組與其它兩組比有顯著的統(tǒng)計學差異(P<0.001=AQP<,1>的主要功能是參與水的跨膜轉(zhuǎn)運，地塞米松增加胸膜間皮細胞上AQP<,1>mRNA的表達，為胸腔積液的治療提供理論依據(jù)． 研究結(jié)論： 一、兩種取材方法均可以成功建立間皮細胞體外培養(yǎng)模型，方法學上均有可行性；手術(shù)標本所得細胞有