DIXDC1通過PI3K-AKT-AP-1途徑促進肺癌侵襲轉移.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、前言:
  DIXDC1是新近被克隆的與人類Wnt信號通路調節(jié)有關的新基因,由于其為斑
  馬魚ccd1基因(Coiled-coil-DIX1)在人類的同源異構體,故被命名為DIXDC1。DIXDC1有四種不同的亞型,其中在人類表達的主要亞型是1和2,亞型1代表全長DIXDC1即L-DIXDC1,亞型2是缺失了CH(calponin-homology)環(huán)的DIXDC1,即S-DIXDC1,與斑馬魚中的ccd1結構類似。在斑馬

2、魚神經(jīng)管發(fā)育過程中被證實ccd1蛋白通過與Dvls的結合,加強Dvls的激活作用,促進經(jīng)典Wnt信號通路的活性。但到目前為止,僅有報道指出DIXDC1蛋白在人類結腸癌中有高表達,并發(fā)現(xiàn)DIXDC1與beta-catenin蛋白有共定位、對結腸癌細胞的增殖有促進作用,并且發(fā)現(xiàn)DIXDC1蛋白在結直腸癌中雖然高表達,其mRNA卻低表達。但是,DIXDC1在人類其他腫瘤中的表達情況及意義尚不清楚,其調控腫瘤細胞增殖或侵襲的分子機制等都有待于進

3、一步探討。
  在本研究中,我們用免疫組化和western blot等方法檢測了DIXDC1的蛋白在肺癌組織和細胞系中的表達,通過雙向調控DIXDC1的表達,采用TOPflash和AP-1報告基因的方法,初步探討了DIXDC1對肺癌細胞侵襲的影響和可能的作用機制。
  材料與方法:
  一、組織標本與病人資料
  167例非小細胞肺癌組織和35例癌旁正常肺組織蠟塊均來自于中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院病理科,所有患者術

4、前均未接受化療或放射治療?;颊咂骄挲g60歲。根據(jù)WHO2004肺癌組織學分類標準,腺癌94例,鱗癌73例。根據(jù)2009年國際抗癌聯(lián)盟TNM分期標準,Ⅰ期56例,Ⅱ期33例,Ⅲ期73例,Ⅳ期5例。在167例肺癌病例中具有完整隨訪資料的73例。隨訪是從手術之日起到隨訪結束日期或由于復發(fā)、轉移而死亡之日止。另收集17例新鮮的肺癌組織及相對應的癌旁正常的肺組織,保存在-70℃冰箱內,用于提取蛋白質和RNA。
  二、免疫組織化學染色

5、r>  采用Streptavidin-Peroxidase(SP)免疫組織化學方法進行染色,檢測DIXDC1在167例NSCLC標本中的表達及其與各臨床病理因素之間的關系,也檢測了另73例隨訪標本中DIXDC1表達與患者預后的關系。DIXDC1陽性結果的判定參考Lu Q等的標準。光鏡下計數(shù)400個腫瘤細胞,以免疫染色的強度(0=negative,1=weak,2=moderate,3=strong)和免疫染色的陽性細胞數(shù)(0=absen

6、t,1=1~25%,2=26~50%,3=51~75%,4=≥76%)兩項評分相乘得到的分數(shù)作為每例標本的最終分數(shù),<3分為陰性表達,≥3分為陽性表達。
  三、細胞培養(yǎng),質粒構建與轉染
  人肺腺癌細胞系A549和H1299培養(yǎng)于含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中。將DIXDC1質粒(pcs2-Ccd1A和pcs2-Ccd1B cDNAs)導入DIXDC1表達較低的A549細胞系;選擇干擾效果較好的DIXDC1 s

7、iRNA序列(5'-CGCCCUUCAUGGUCAAUAUTT-3',5'-AUAUUGACCAUGAAGGGCGTT-3')導入DIXDC1表達較高的H1299細胞系。
  四、Western Blotting與RT-qPCR
  應用Western Blotting與RT-qPCR檢測肺癌及癌旁正常肺組織中DIXDC1的蛋白和mRNA表達情況。
  五、報告基因檢測
  我們在24孔板培養(yǎng)的H1299/A54

8、9細胞共轉染相關報告基因質粒topflsh/AP-1(0.4ug/孔)和pcs2-ccd1A和pcs2-1B((0.4ug/孔)質粒,24小時之后提取細胞裂解物進行相關報告基因檢測,所有結果(mean±SD)均以pRL-TK報告基因活性為標準,以pcs2空質粒為對照。
  六、細胞侵襲能力的測定
  為了觀察DIXDC1對肺癌細胞生物學行為的影響,我們分別過表達與敲除DIXDC1,以及使用PI3K-AKT抑制劑LY29400

9、2和AP-1特異性轉錄因子抑制物誘騙寡核苷酸(5'-TGTCTGACTCATGTC-3',5'-ACAGACTGAGTACAG-3')后,用基質膠侵襲試驗測定細胞侵襲能力,同時對MMPs進行蛋白和mR.NA水平檢測。
  結果:
  一、DIXDC1在肺癌組織中高表達并與患者的不良預后相關
  DIXDC1在正常支氣管上皮細胞和肺泡上皮的胞漿中呈現(xiàn)弱的信號,根據(jù)我們的評分標準判定為陰性表達。在肺癌組織中DIXDC1的陽

10、性信號定位于胞漿,其陽性表達率為55%(92/167),明顯高于正常肺組織的表達水平(P<0.001)。;Ⅲ-Ⅳ期的陽性表達率顯著高于Ⅰ-Ⅱ期(P<0.05);有LN轉移的病例陽性表達率也明顯高于無LN轉移的病例(P<0.05)。但DIXDC1的陽性表達與患者年齡、性別和分化程度均未見關聯(lián)性(P>0.05)。Kaplan-Meier生存分析表明,DIXDC1陽性表達患者的平均生存時間短于陰性表達者(P=0.031)。正常肺組織中DIXD

11、C1的蛋白表達均低于配對的肺癌組織(P<0.05),但是mRNA表達卻高于配對的肺癌組織。
  二、DIXDC1蛋白在在肺癌細胞系中高表達并且促進肺癌的侵襲能力
  用Westernblot方法檢測了7種肺癌細胞系中DIXDC1的蛋白表達情況,發(fā)現(xiàn)DIXDC1蛋白含量在各種肺癌細胞系中均明顯高于正常支氣管上皮細胞系HBE(P<0.05)。
  在DIXDC1表達相對較低的A549細胞系中分別轉染pcs2-ccd1 A(

12、L-DIXDC1)和pcs2-ccd1B(S-DIXDC1),發(fā)現(xiàn)和侵襲對照組相比,轉染兩種質粒后均能增強細胞的侵襲能力(P<0.05),但相對于轉移的對照組,轉染pcs2-ccd1A(L-DIXDC1)后細胞的轉移能力明顯強于轉染pcs2-ccd1B(S-DIXDC1)(P<0.05)。
  三、DIXDC1既可上調經(jīng)典的Wnt/β-catenin通路又可激活PI3K-AKT依賴的AP-1活性
  在H1299和A549肺

13、癌細胞系中過表達DIXDC1,發(fā)現(xiàn)經(jīng)典Wnt通路報告基因活性TOPflash出現(xiàn)了有意義的上調(P<0.05),但同時我們發(fā)現(xiàn),轉染DIXDC1后轉錄因子AP-1報告基因的活性也出現(xiàn)了明顯的增強(P<0.05),預示著DIXDC1對AP-1通路也有激活作用。我們檢測了PI3K-AKT通路中的AKT的磷酸化水平,發(fā)現(xiàn)轉染DIXDC1后磷酸化的AKT水平明顯增強(P<0.05),而轉染DIXDC1后加入PI3K-AKT的抑制劑LY29400

14、2,磷酸化AKT水平受到明顯抑制(P<0.05),同時AP-1的活性明顯下降(P<0.05),TOPflash沒有明顯的改變,此時transwell檢測結果發(fā)現(xiàn)細胞的侵襲能力受到明顯抑制(P<0.05)。
  四、DIXDC1通過PI3K-AKT/AP-1通路激活MMPs促進肺癌的侵襲能力
  我們在H1299細胞系中分別過表達和干擾DIXDC1之后,檢測了MMP2,MMP7和MMP9的蛋白和mRNA水平,我們發(fā)現(xiàn)當轉染pc

15、s2-ccd1A和pcs2-ccd1B質粒后MMP2、MMP9和MMP7均有明顯升高,而干擾DIXDC1后MMP2、MMP9和MMP7均有下降(P均<0.05)。為了驗證DIXDC1是否通過PI3K/AKT/AP-1途徑影響MMPs的活性,我們分別應用PI3K的抑制劑LY294002和AP-1的特異性轉錄因子抑制物誘騙寡核苷酸(decoy oligodeoxynucleotide,decoy ODN)處理后,轉染DIXDC1質粒,對MM

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