DIXDC1通過PI3K-AKT-AP-1途徑促進肺癌侵襲轉(zhuǎn)移.pdf

1、前言：
　　DIXDC1是新近被克隆的與人類Wnt信號通路調(diào)節(jié)有關(guān)的新基因，由于其為斑
　　馬魚ccd1基因(Coiled-coil-DIX1)在人類的同源異構(gòu)體，故被命名為DIXDC1。DIXDC1有四種不同的亞型，其中在人類表達的主要亞型是1和2，亞型1代表全長DIXDC1即L-DIXDC1，亞型2是缺失了CH(calponin-homology)環(huán)的DIXDC1，即S-DIXDC1，與斑馬魚中的ccd1結(jié)構(gòu)類似。在斑馬

2、魚神經(jīng)管發(fā)育過程中被證實ccd1蛋白通過與Dvls的結(jié)合，加強Dvls的激活作用，促進經(jīng)典Wnt信號通路的活性。但到目前為止，僅有報道指出DIXDC1蛋白在人類結(jié)腸癌中有高表達，并發(fā)現(xiàn)DIXDC1與beta-catenin蛋白有共定位、對結(jié)腸癌細胞的增殖有促進作用，并且發(fā)現(xiàn)DIXDC1蛋白在結(jié)直腸癌中雖然高表達，其mRNA卻低表達。但是，DIXDC1在人類其他腫瘤中的表達情況及意義尚不清楚，其調(diào)控腫瘤細胞增殖或侵襲的分子機制等都有待于進

3、一步探討。
　　在本研究中，我們用免疫組化和western blot等方法檢測了DIXDC1的蛋白在肺癌組織和細胞系中的表達，通過雙向調(diào)控DIXDC1的表達，采用TOPflash和AP-1報告基因的方法，初步探討了DIXDC1對肺癌細胞侵襲的影響和可能的作用機制。
　　材料與方法:
　　一、組織標本與病人資料
　　167例非小細胞肺癌組織和35例癌旁正常肺組織蠟塊均來自于中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科，所有患者術(shù)

4、前均未接受化療或放射治療?；颊咂骄挲g60歲。根據(jù)WHO2004肺癌組織學(xué)分類標準，腺癌94例，鱗癌73例。根據(jù)2009年國際抗癌聯(lián)盟TNM分期標準，Ⅰ期56例，Ⅱ期33例，Ⅲ期73例，Ⅳ期5例。在167例肺癌病例中具有完整隨訪資料的73例。隨訪是從手術(shù)之日起到隨訪結(jié)束日期或由于復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移而死亡之日止。另收集17例新鮮的肺癌組織及相對應(yīng)的癌旁正常的肺組織，保存在-70℃冰箱內(nèi)，用于提取蛋白質(zhì)和RNA。
　　二、免疫組織化學(xué)染色

5、r>　　采用Streptavidin-Peroxidase(SP)免疫組織化學(xué)方法進行染色，檢測DIXDC1在167例NSCLC標本中的表達及其與各臨床病理因素之間的關(guān)系，也檢測了另73例隨訪標本中DIXDC1表達與患者預(yù)后的關(guān)系。DIXDC1陽性結(jié)果的判定參考Lu Q等的標準。光鏡下計數(shù)400個腫瘤細胞，以免疫染色的強度(0=negative，1=weak，2=moderate，3=strong)和免疫染色的陽性細胞數(shù)(0=absen

6、t，1=1～25％，2=26～50％，3=51～75％，4=≥76％)兩項評分相乘得到的分數(shù)作為每例標本的最終分數(shù)，＜3分為陰性表達，≥3分為陽性表達。
　　三、細胞培養(yǎng)，質(zhì)粒構(gòu)建與轉(zhuǎn)染
　　人肺腺癌細胞系A(chǔ)549和H1299培養(yǎng)于含10％ FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中。將DIXDC1質(zhì)粒（pcs2-Ccd1A和pcs2-Ccd1B cDNAs）導(dǎo)入DIXDC1表達較低的A549細胞系;選擇干擾效果較好的DIXDC1 s

7、iRNA序列(5'-CGCCCUUCAUGGUCAAUAUTT-3',5'-AUAUUGACCAUGAAGGGCGTT-3')導(dǎo)入DIXDC1表達較高的H1299細胞系。
　　四、Western Blotting與RT-qPCR
　　應(yīng)用Western Blotting與RT-qPCR檢測肺癌及癌旁正常肺組織中DIXDC1的蛋白和mRNA表達情況。
　　五、報告基因檢測
　　我們在24孔板培養(yǎng)的H1299/A54

8、9細胞共轉(zhuǎn)染相關(guān)報告基因質(zhì)粒topflsh/AP-1（0.4ug/孔）和pcs2-ccd1A和pcs2-1B（（0.4ug/孔）質(zhì)粒，24小時之后提取細胞裂解物進行相關(guān)報告基因檢測，所有結(jié)果(mean±SD)均以pRL-TK報告基因活性為標準，以pcs2空質(zhì)粒為對照。
　　六、細胞侵襲能力的測定
　　為了觀察DIXDC1對肺癌細胞生物學(xué)行為的影響，我們分別過表達與敲除DIXDC1，以及使用PI3K-AKT抑制劑LY29400

9、2和AP-1特異性轉(zhuǎn)錄因子抑制物誘騙寡核苷酸（5'-TGTCTGACTCATGTC-3'，5'-ACAGACTGAGTACAG-3'）后，用基質(zhì)膠侵襲試驗測定細胞侵襲能力，同時對MMPs進行蛋白和mR.NA水平檢測。
　　結(jié)果:
　　一、DIXDC1在肺癌組織中高表達并與患者的不良預(yù)后相關(guān)
　　DIXDC1在正常支氣管上皮細胞和肺泡上皮的胞漿中呈現(xiàn)弱的信號，根據(jù)我們的評分標準判定為陰性表達。在肺癌組織中DIXDC1的陽

10、性信號定位于胞漿，其陽性表達率為55％(92/167)，明顯高于正常肺組織的表達水平(P＜0.001)。;Ⅲ-Ⅳ期的陽性表達率顯著高于Ⅰ-Ⅱ期(P＜0.05);有LN轉(zhuǎn)移的病例陽性表達率也明顯高于無LN轉(zhuǎn)移的病例(P＜0.05)。但DIXDC1的陽性表達與患者年齡、性別和分化程度均未見關(guān)聯(lián)性(P＞0.05)。Kaplan-Meier生存分析表明，DIXDC1陽性表達患者的平均生存時間短于陰性表達者(P=0.031)。正常肺組織中DIXD

11、C1的蛋白表達均低于配對的肺癌組織(P＜0.05)，但是mRNA表達卻高于配對的肺癌組織。
　　二、DIXDC1蛋白在在肺癌細胞系中高表達并且促進肺癌的侵襲能力
　　用Westernblot方法檢測了7種肺癌細胞系中DIXDC1的蛋白表達情況，發(fā)現(xiàn)DIXDC1蛋白含量在各種肺癌細胞系中均明顯高于正常支氣管上皮細胞系HBE(P＜0.05)。
　　在DIXDC1表達相對較低的A549細胞系中分別轉(zhuǎn)染pcs2-ccd1 A(

12、L-DIXDC1)和pcs2-ccd1B(S-DIXDC1)，發(fā)現(xiàn)和侵襲對照組相比，轉(zhuǎn)染兩種質(zhì)粒后均能增強細胞的侵襲能力(P＜0.05)，但相對于轉(zhuǎn)移的對照組，轉(zhuǎn)染pcs2-ccd1A(L-DIXDC1)后細胞的轉(zhuǎn)移能力明顯強于轉(zhuǎn)染pcs2-ccd1B(S-DIXDC1)(P＜0.05)。
　　三、DIXDC1既可上調(diào)經(jīng)典的Wnt/β-catenin通路又可激活PI3K-AKT依賴的AP-1活性
　　在H1299和A549肺

13、癌細胞系中過表達DIXDC1，發(fā)現(xiàn)經(jīng)典Wnt通路報告基因活性TOPflash出現(xiàn)了有意義的上調(diào)（P＜0.05），但同時我們發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染DIXDC1后轉(zhuǎn)錄因子AP-1報告基因的活性也出現(xiàn)了明顯的增強(P＜0.05)，預(yù)示著DIXDC1對AP-1通路也有激活作用。我們檢測了PI3K-AKT通路中的AKT的磷酸化水平，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染DIXDC1后磷酸化的AKT水平明顯增強（P＜0.05），而轉(zhuǎn)染DIXDC1后加入PI3K-AKT的抑制劑LY29400

14、2，磷酸化AKT水平受到明顯抑制(P＜0.05)，同時AP-1的活性明顯下降(P＜0.05)，TOPflash沒有明顯的改變，此時transwell檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)細胞的侵襲能力受到明顯抑制(P＜0.05)。
　　四、DIXDC1通過PI3K-AKT/AP-1通路激活MMPs促進肺癌的侵襲能力
　　我們在H1299細胞系中分別過表達和干擾DIXDC1之后，檢測了MMP2，MMP7和MMP9的蛋白和mRNA水平，我們發(fā)現(xiàn)當轉(zhuǎn)染pc

15、s2-ccd1A和pcs2-ccd1B質(zhì)粒后MMP2、MMP9和MMP7均有明顯升高，而干擾DIXDC1后MMP2、MMP9和MMP7均有下降(P均＜0.05）。為了驗證DIXDC1是否通過PI3K/AKT/AP-1途徑影響MMPs的活性，我們分別應(yīng)用PI3K的抑制劑LY294002和AP-1的特異性轉(zhuǎn)錄因子抑制物誘騙寡核苷酸(decoy oligodeoxynucleotide，decoy ODN)處理后，轉(zhuǎn)染DIXDC1質(zhì)粒，對MM