垂體生長激素腺瘤靶向性基因治療的實驗研究.pdf

1、我們對受體介導的GE7基因?qū)胂到y(tǒng)的靶向性轉染及垂體生長激素啟動子的靶向性轉錄進行了評價,并將二者結合應用于垂體腺瘤的基因治療,進行了以下幾方面的探索:1.大鼠垂體生長激素腺瘤(GH<,3>)細胞、人骨髓瘤(U-2OS)細胞和人卵巢癌(HO8910PM)細胞表面表皮生長因子受體(EGFP)的表達;目的:判明實驗細胞GH<,3>細胞、U-2OS細胞和HO8910PM細胞的EGFR表達情況.方法:實驗中應用免疫組織化學的方法,取細胞附壁良好

2、的蓋玻片,經(jīng)內(nèi)酮固定,1％H<,2>O<,2>作用,非免疫羊血清覆蓋,依次加一抗、二抗孵化,0.05％DAB+0.03％H<,2>O<,2>顯色,蘇木素襯染、分化,封片,鏡檢,棕黃色為陽性結果.結論:實驗證明GH<,3>細胞、HO8910PM細胞表面EGFR強表達,U-2OS細胞表面無EGFR表達.該研究擬應用EGFP介導的GE7基因?qū)胂到y(tǒng)達到靶向性基因轉染的目的.這一結果表明:(1)GH<,3>細胞可以作為GE7基因?qū)胂到y(tǒng)基因治療

3、研究的實驗細胞;(2)U-2OS細胞可以作為陰性對照細胞;(3)HO8910MP細胞可以作為陽性對照細胞.2.細胞特異性表達質(zhì)粒的構建;目的:構建人生長激素啟動子(human growth hormone promoter,hGHp)調(diào)控的報告基在及殺傷基因表達質(zhì)粒.方法:根據(jù)GenBank中hGHp的核苷酸序列和基因克隆的要求,用PCGENE軟件進行分析,選擇最佳擴增引物,通過聚合酶鏈式反應(PCR),得到hGHp的克隆,經(jīng)測序證實.

4、將作為載體的質(zhì)粒pGL3-Basic雙酶切,并與hGHp粘端連接,構建報告質(zhì)粒pGL3-Basic-hGHp.通過相似的步驟完成殺傷基因質(zhì)粒pcDNA3.1/His A-hGHp-TK的構建.結論:應用分子生物學實驗技術,可以得到正確的hGHp片段,并通過重組質(zhì)粒的方法,成功構建hGHp調(diào)控的報告基因及殺傷基因質(zhì)粒.3.基因治療系統(tǒng)轉染及表達的研究;目的:評價基因治療系統(tǒng)的有效性及靶向性.方法:應用GE7基因?qū)胂到y(tǒng),將報告質(zhì)粒pGL3

5、-Basic-hGHp分別轉染GH<,3>、U-2OS及HO8910PM細胞,通過測定報告基因——熒光素酶(luciferase,Luc)基因表達活性,證明基因治療系統(tǒng)的有效性和靶向性.同樣應用GE7基因?qū)胂到y(tǒng),將殺傷基因質(zhì)粒pcDNA3.1/His A-hGHp-TK轉染GH<,3>、U-2OS及HO8901PM細胞,經(jīng)Western blot檢測,證明基因治療系統(tǒng)的有效性和靶向性.同時,研究轉染GH<,3>細胞的最佳劑量、最佳轉染

6、時間及表達時間.結論:(1)研究所采用的基因治療系統(tǒng)是高效的,能夠?qū)⒆懔康哪康幕驅(qū)爰毎?并保證目的基因有較高的表達.(2)該基因治療系統(tǒng)具有較強的靶向性,其中GE7基因?qū)胂到y(tǒng)的靶向性轉染,將目的基因?qū)隕GFR高表達的細胞;生長激素啟動子的靶向性轉錄調(diào)控目的基因只在分泌生長激素的細胞中轉錄并表達;二者結合的雙重靶向性保證目的基因只在GH<,3>細胞中發(fā)揮作用.4.基因治療的體外實驗;目的:評價基因治療系統(tǒng)進行體外細胞殺傷實驗的效果

7、和靶向性.方法:應用GE7系統(tǒng)將pcDNA3.1/HisA-hGHp-TK分別轉染GH<,3>、U-2OS和HO8910PM三種細胞24小時,換完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24小時,加入GCV0.1μg/孔,培養(yǎng)48小時,MTT法觀察細胞殺傷靶向性.GH<,3>細胞GE7轉染pcDNA3.1/HisA-hGHp-TK后,按0.1.2.4.8.16μg/ml16個梯度加入GCV 0.1ml/孔,培養(yǎng)48小時,MTT法觀察GCV的殺傷效果,選擇最佳G

8、CV濃度(最低的有效濃度).GH<,3>細胞GE7轉染pcDNA3.1/HisA-hGHp-TK,24小時后加入GCV,培養(yǎng)24小時,每隔24小時更換1次GCV,MTT法在第1~7天每天觀察殺傷效果.結論:(1)應用GE7轉染的hGHp調(diào)控的HSV-TK基因能將無毒藥物前體GCV代謝成毒性產(chǎn)物,有效殺傷腫瘤細胞.(2)該基因治療系統(tǒng)能特異性殺傷靶細胞——GH<,3>細胞,而對作為對照的U-2OS和HO8910PM細胞沒有影響.(3)對于

9、GH<,3>細胞,GCV最佳殺傷濃度為4μg/ml;轉染并用GCV殺傷3天后GH<,3>細胞增殖速度明顯減慢.5.基因治療的動物實驗研究;目的:建立垂體腺瘤動物模型,觀察體內(nèi)基因治療的效果.方法:將GH<,3>細胞懸液(1.0×10<'7>)注射于裸鼠右腋皮下,制成垂體腺瘤裸鼠模型.瘤體內(nèi)直接注射GE7介導的pcDNA3.1/HisA-hGHp-TK(2.0μg),24小時后腹腔注射GCV(100mg·kg<'-1>.d<'-1>),第