嗅球成鞘細胞復合PLGA導管對大鼠坐骨神經(jīng)缺損的修復作用.pdf

1、雖然顯微外科技術(shù)的發(fā)展極大地提高了周圍神經(jīng)缺損修復的質(zhì)量，但修復效果仍不令人滿意。尤其是嚴重創(chuàng)傷、腫瘤切除以及先天性畸形等原因引起的周圍神經(jīng)缺損，其修復與重建仍是臨床上治療的難點。自體神經(jīng)移植是目前臨床上首選的神經(jīng)重建方法，但由于供體神經(jīng)缺乏、修復長度有限、供體區(qū)域功能喪失、神經(jīng)瘤和自發(fā)神經(jīng)痛等問題，其臨床應用受到很大限制。近些年來，隨著合成材料學、生物工程學等學科的不斷進展，組織工程化人工神經(jīng)給人們帶來新的期望。嗅球成鞘細胞(olfa

2、ctoryensheathing cells，OECs)是一種特殊類型的膠質(zhì)細胞，具有很強的促進軸突再生和形成髓鞘的能力。聚乳酸-聚羥基乙酸共聚物(poly(DL-lactide-co-glycolide)，PLGA)是一種生物可降解性合成材料，具有來源豐富、組織相容性好、可塑性強等優(yōu)點，被認為是一種較為理想的人工神經(jīng)支架材料?；谏鲜霰尘?，本實驗采用急性分離的OECs復合PLGA導管，伍用細胞外基質(zhì)凝膠修復大鼠坐骨神經(jīng)缺損，旨在尋找修

3、復周圍神經(jīng)缺損的可行方法，并豐富周圍神經(jīng)缺損的修復理論。 本實驗第一部分采用改良的Sasaki(2004年)方法，嗅神經(jīng)層和顆粒層取材、分離和培養(yǎng)OECs，培養(yǎng)3d后用NGFRp75、S-100進行免疫熒光鑒定，以確定OECs的純度。第二部分將急性分離的OECs接種于PLGA膜上，通過倒置相差顯微鏡、掃描電鏡觀察OECs在PLGA膜上粘附、生長情況；MTT、流式細胞術(shù)等方法測定OECs接種于PLGA膜后細胞增殖和細胞周期的變化情

4、況，以探討PLGA與OECs的細胞相容性。第三部分建立10mm的大鼠右側(cè)坐骨神經(jīng)缺損模型，用CM-DiI標記的OECs復合PLGA導管進行修復，同時設OECs+硅膠管組，PLGA組和硅膠管組為對照，在術(shù)后8w的時間內(nèi)進行細胞示蹤、再生神經(jīng)功能學評價和組織學評價、靶組織功能評價、逆行示蹤和脊髓前角細胞計數(shù)等檢測，從而探討OECs復合PLGA導管對坐骨神經(jīng)再生及靶組織功能恢復的促進作用和對上位運動神經(jīng)元的保護作用。 所取得的主要結(jié)果

5、如下： 1．倒置顯微鏡下，OECs立體感強，胞體清晰，呈雙極或多極，突起細長。NGFRp75和S-100免疫熒光鑒定雙陽性。急性分離的OECs純度為50％～60％。 2.PLGA組OECs形態(tài)特征與對照組無明顯差異。MTT檢測證實PLGA對OECs的代謝活動無顯著影響(直接細胞毒性實驗評價為1級)。PLGA組OECs的細胞周期與對照組無顯著差異，其DNA指數(shù)在正常范圍內(nèi)(1.0±0.1)，OECs為正常二倍體細胞，PLG

6、A對OECs無致癌作用，二者聯(lián)合應用對機體無害。 3.CM-DiI標記的OECs存活時間可達6w，移植細胞沿神經(jīng)縱軸分布，PLGA導管內(nèi)OECs的存活時間長于硅膠管。 4.術(shù)后8w時，OECs+PLGA組足跟部潰瘍愈合率為83.3％，再生神經(jīng)相對直徑恢復率為58.0±2.9％，無自食現(xiàn)象，一般情況明顯優(yōu)于其它三組。橋接的PLGA導管具有光滑的神經(jīng)樣外表，與周圍組織無明顯粘連，表面有少量淺表血供形成；而硅膠管表面有一層結(jié)締

7、組織膜形成，表面無血供形成。 5.術(shù)后6w時，OECs+PLGA組首先出現(xiàn)感覺功能的改善，其平均回縮時間為3.05±0.11see，明顯短于同期其它三組(P<0.05)。術(shù)后8w時，OECs+PLGA組感覺功能繼續(xù)好轉(zhuǎn)，OECs+硅膠管組回縮時間也減至3.06±0.09sec，與PLGA組和硅膠管組差異顯著(P<0.05)。各組的坐骨神經(jīng)功能指數(shù)在8w的觀測時間內(nèi)，均無明顯改善。OECs+PLGA組動作電位的潛伏期最短(3.10

8、±0.11ms)，其神經(jīng)傳導速度為19.38±0.70m/s，與其它三組差異顯著(P<0.05)。OECs+PLGA組復合肌肉動作電位的波幅為3.21±0.47mV.，也遠高于其它三組(P<0.01)。 6.術(shù)后8w時，OECs+PLGA組腓腸肌濕重恢復率為67.22±4.46％，顯著高于其它三組。同時，OECs+PLGA組的運動終板單位數(shù)量最接近于正常，為55.5±3.7個，體積在四組中最大，長軸為41.5±8.8pm，短軸為

9、22.5±3.8μm，也顯著優(yōu)于其它三組(P<0.05)。 7.術(shù)后8w時，各組逆行示蹤檢測均有陽性神經(jīng)元發(fā)現(xiàn)。OECs+PLGA組實驗側(cè)與對照側(cè)陽性神經(jīng)元個數(shù)百分比為77.1±3.0％，與OECs+硅膠管組相比無顯著差異(P>0.05)，但與PLGA組和硅膠管組差異顯著(P<0.05)。同時，OECs+PLGA組與OECs+硅膠管組的術(shù)側(cè)脊髓前角外側(cè)群大、中型運動神經(jīng)元數(shù)量分別為9.2±0.8個和9.2±0.4個，明顯高于無細

10、胞移植的兩組(P<0.05)。 8.術(shù)后8w時，再生神經(jīng)甲苯胺蘭染色計量結(jié)果示OECs+PLGA組再生神經(jīng)中段水平有髓神經(jīng)纖維密度為17713±2505/mm<'2>，明顯高于其它三組(P<0.05)。OECs+PLGA組的再生神經(jīng)中段總神經(jīng)纖維數(shù)為6627±1032，與OECs+硅膠管組無明顯差異(.P>0.05)，但明顯優(yōu)于無細胞移植的兩組(P<0.05)。再生神經(jīng)遠段水平OECs+PLGA組和OECs+硅膠管組的上述兩項指

11、標顯著優(yōu)于PLGA組和硅膠管組(P<0.05)。透射電鏡顯示再生神經(jīng)中段水平OECs+PLGA組有髓纖維的成熟度最高，無髓纖維數(shù)量最少，OECs+硅膠管組成熟度次之，PLGA組和硅膠管組最低。各組再生神經(jīng)遠段水平透射電鏡觀察結(jié)果與中段相似。 以上結(jié)果表明： 1．PLGA對OECs的形態(tài)特征、增殖能力、細胞周期及倍體水平無顯著影響，PLGA與OECs具有良好的生物相容性，適于構(gòu)建組織工程化人工神經(jīng)。 2．CM-Di