腸出血型大腸埃希菌O157：H7 IntC300 B細胞抗原表位的預(yù)測及免疫保護研究.pdf

1、研究背景和目的： 腸出血型大腸埃希菌(EnterohaemorrhagicE.coli，EHEC)O157：H7是一種新現(xiàn)腸道致病菌，能引起人出血性腸炎(Hemorrhagiccolitis，HC)、溶血性尿毒綜合征(Hemolyticuremicsyndrome，HUS)和血栓性血小板減少性紫癜(Thromboticthromobocytopenieporpura，TTP)等。 1982年在美國密執(zhí)安州和俄勒岡州，Ri

2、ley等報道了因食漢堡包引起的食物中毒事件，最后確認病原菌是EHECO157：H7。隨后世界各地均有發(fā)生EHECO157：H7流行。美國于1993年發(fā)生了一次涉及到4個州700余名兒童的EHECO157：H7暴發(fā)，其中51例發(fā)生了HUS，4例死亡。1996年5—8月在日本發(fā)生了一起涉及30多個縣市的的EHECO157：H7暴發(fā)流行，患者9000余名，死亡9人。1999-2000年我國蘇皖等地發(fā)生的EHECO157：H7大規(guī)模暴發(fā)流行，患

3、者約2萬人，發(fā)生急性腎功能衰竭者195人，死亡人數(shù)177人，可能是迄今為止世界上流行規(guī)模最大、死亡人數(shù)最多、流行時間最長、發(fā)病原因最復(fù)雜的一次。EHECO157：H7的感染呈暴發(fā)流行趨勢，具有強烈的致病性與致死性，已成為全球性的公共衛(wèi)生問題。 EHECO157：H7致病性相關(guān)的毒力因子有緊密黏附素(Intimin)、志賀毒素1型、2型(Shigatoxin，Stx1、Stx2)和溶血素(Haemolysin，Hly)等。EHEC

4、O157：H7的致病作用主要通過細菌對腸黏膜上皮細胞粘附和產(chǎn)生毒素兩個過程。EHECO157：H7侵入機體后，通過菌毛局限性地粘附在盲腸和結(jié)腸上皮細胞的刷狀緣上并損害微絨毛，此后細菌染色體LEE(Locusofenterocyteeffacement)毒力島上的eae基因編碼的Intimin介導(dǎo)細菌緊密粘附在腸上皮細胞膜上，導(dǎo)致在腸上皮細胞與細菌接觸處的鄰近部位肌動蛋白和肌球蛋白等積聚，形成墊狀結(jié)構(gòu)，這種損害被稱為粘附—抹去(Attac

5、hingandeffacinglesion，A/Elesion)損傷。在EHECO157：H7特征性A/E損傷的發(fā)生過程中，Intimin起非常重要的作用，有研究表明Intimin是EHECO157：H7在人腸道粘膜定居并引起A/E損傷所必需。Tzipoai等使染色體上eae基因突變致EHECO157：H7不能粘附到上皮細胞，當eae基因用質(zhì)粒載入后，細菌的粘附能力隨即得到恢復(fù)，從而進一步證實了Intimin與致病能力的關(guān)系。

6、目前，在EHECO157：H7的快速檢測、致病機制、藥物研制等仍存在許多問題，因此研究EHECO157：H7的疫苗成為防治其感染的重要內(nèi)容。有研究已證實：IntiminC末端280至300個氨基酸殘基(IntC280-300)具有很強的免疫保護性。其特異性抗體可以阻斷細菌的黏附進而使其喪失致病力，是理想的疫苗備選抗原。國內(nèi)外已有研究選擇IntC300作為疫苗的備選抗原，易勇等利用基因重組技術(shù)構(gòu)建了Stx2B—IntC300融合蛋白疫苗，

7、以致死劑量的EHECO157：H7超聲破菌液對免疫小鼠進行攻毒試驗，融合蛋白的免疫保護作用為65％，與EHECO157：H7全菌滅活抗原的保護水平相當。Judge等將編碼EHECO157：H7IntiminC末端的基因重組入馬鈴薯染色體中，構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因馬鈴薯細胞且能成功表達Intimin蛋白。據(jù)此研制了口服植物疫苗，對小鼠免疫并攻毒EHECO157：H7活菌后發(fā)現(xiàn)能縮短小鼠感染期且減少排菌量。 在上述疫苗研制過程中仍存在一些困難

8、：制備亞單位疫苗，需要表達融合蛋白，抗原制備繁瑣；而轉(zhuǎn)基因植物疫苗則存在疫苗在人胃腸道易被分解的問題。合成肽疫苗(Syntheticpeptidevaccine)是用化學(xué)合成抗原表位氨基酸序列法制備而成的具有保護性作用的類似天然抗原決定簇的多肽疫苗，合成肽疫苗具有安全、廉價、特異性強、易于保存和應(yīng)用等特點。合成肽疫苗的研究最早始于口蹄疫病毒(FMDV)的合成肽疫苗，Bittll等按照O型口蹄疫病毒VP1的氨基酸序列合成了7種多肽，將這些

9、多肽和鑰孔槭血藍蛋白(Keyholelimpethemocyanin，KLH)偶聯(lián)，然后與弗氏完全佐劑乳化，制備成合成肽疫苗，能夠產(chǎn)生足夠的抗體，保護牛和豬不發(fā)病。 本研究選擇對EHECO157：H7IntC300B細胞抗原表位進行預(yù)測，選擇一條抗原表位多肽進行合成，然后免疫動物，檢測其免疫保護作用，為篩選其抗原表位及進一步研究多肽疫苗提供理論依據(jù)。 研究方法： 1.EHECO157：H7IntC300B細胞抗原

10、表位的預(yù)測根據(jù)從GenBank上查到的EHECO157：H7標準株EDL933Intimin的氨基酸序列(Acessionnumber：CAA77642)，選其C末端300個氨基酸(635—934)為目的片斷；采用DNASTAR軟件分析IntC300的親水性、β-轉(zhuǎn)角、柔韌性、表面可及性和抗原指數(shù)；利用網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器(http://bio.dfci.harvard.edu/Tools/antigenic.p1)預(yù)測IntC300的B細胞抗原

11、趨勢；綜合各種參數(shù)分析的結(jié)果，預(yù)測出一組EHECO157：H7IntC300B細胞抗原表位多肽。 2.IntC300B細胞抗原表位的抗體效價測定合成一條EHECO157：H7IntC300B細胞抗原表位多肽，序列為：KASITEIKADKT。將抗原多肽與KLH偶聯(lián)。將6～8周齡的SPF級BALB/c小鼠60只，隨機分為4組：皮下免疫組，皮下免疫對照組，鼻腔免疫組，鼻腔免疫對照組，每組15只。將偶聯(lián)產(chǎn)物與弗氏完全佐劑或霍亂毒素B亞

12、單位(CholeratoxinBsubunit，CTB)混合后通過皮下和鼻腔兩種途徑免疫小鼠，對照組用PBS免疫，每間隔2周加強免疫一次，2、3次免疫后7d每組隨機抽10只小鼠從眼眶采集血清，間接ELISA法檢測小鼠血清抗體效價。 3.動物攻毒實驗?zāi)┐蚊庖?0d后以EHECO157：H7活菌進行動物攻毒實驗，小鼠于攻毒前禁食、禁水12h，每只小鼠經(jīng)食道灌注1×1010CFU/mlEHECO157：H7活菌0.3ml。攻毒后12h

13、恢復(fù)飲食飲水，并記錄動物死亡情況。 結(jié)論： 本研究采用DNASTAR軟件和網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器分析EHECO157：H7IntC300的β-—轉(zhuǎn)角、親水性、可及性、柔韌性、抗原指數(shù)、抗原趨勢等參數(shù)，結(jié)果顯示多肽23-34(KASITEIKADKT)、76—88(QTQATTGNDGRAT)、189-198(KATSGDKQTV)、262-279(KQTSSEQRSGVSSTYNLI)和284-296(LPGVNVNTPNVYA)有

14、可能是EHECO157：H7IntC300的B細胞抗原表位。 本文預(yù)測的EHECO157：H7IntC300的23-34肽段序列KASITEIKADKT與ADU—BOBIE等經(jīng)重疊肽驗證的腸致病型大腸埃希菌(EPEC)O127：H6IntC280的1-20肽段序列ITEIKADKTrAVANGQDAIT相比，有9個氨基酸殘基(ITEIKADKT)是完全相同的。由于編碼Intimin的eae基因在EHEC與EPEC之間有約87％的

15、同源性，它們之間很可能也有相同的抗原位點，所以這個肽段作為EHECO157：H7的抗原位點的可能性也很高。 選擇合成多肽23-34，通過皮下和鼻腔兩種途徑免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)其可在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生特異性IgG和IgA抗體，皮下免疫組的血清IgG抗體滴度達到6400，鼻腔免疫組為1600。鼻腔免疫組獲得的IgA抗體滴度(3200)明顯高于皮下免疫組(100)。對小鼠進行致死量EHECO157：H7活菌攻毒后，皮下免疫組產(chǎn)生的免疫保護性與其對