甜菜夜蛾中腸Cry1Ac-Cry2Aa結(jié)合蛋白的鑒定及功能分析.pdf

1、蘇云金芽孢桿菌(Bt)產(chǎn)生的殺蟲晶體蛋白能夠有效控制農(nóng)業(yè)害蟲。目前，一些殺蟲晶體蛋白基因（cry）已被轉(zhuǎn)入到重要的農(nóng)作物中用于防治田間害蟲。表達(dá)Cry1Ac和Cry2Ab殺蟲蛋白的轉(zhuǎn)基因棉花“BollgardⅡ”能有效控制甜菜夜蛾等棉田的鱗翅目害蟲。然而，大面積種植Bt棉花會(huì)導(dǎo)致田間害蟲對(duì)Bt抗性的產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn)，棉鈴蟲已對(duì)“BollgardⅡ”轉(zhuǎn)基因棉花產(chǎn)生了抗性，甜菜夜蛾同樣也存在對(duì)“BollgardⅡ”轉(zhuǎn)基因棉花產(chǎn)生抗性的風(fēng)險(xiǎn)。但

2、是，關(guān)于Cry1Ac/Cry2Ab殺蟲蛋白對(duì)甜菜夜蛾的作用機(jī)制認(rèn)識(shí)尚不清楚，這將導(dǎo)致不能及時(shí)調(diào)整新的抗性治理策略，從而影響轉(zhuǎn)基因作物的長久使用。本論文中通過蛋白質(zhì)組學(xué)、分子生物學(xué)、昆蟲毒理學(xué)、生物化學(xué)等技術(shù)鑒定了甜菜夜蛾Cry1Ac和Cry2Aa殺蟲蛋白的結(jié)合蛋白，并對(duì)其進(jìn)行受體功能分析。研究結(jié)果為揭示Bt殺蟲蛋白對(duì)甜菜夜蛾的作用機(jī)制和害蟲抗性治理提供理論基礎(chǔ)。
　　主要研究內(nèi)容和結(jié)論如下:
　　1.甜菜夜蛾Cry1Ac結(jié)合

3、蛋白的鑒定
　　通過蛋白質(zhì)單向電泳和配體雜交鑒定得到Cry1Ac的結(jié)合蛋白，進(jìn)一步利用LC-MS/MS分析發(fā)現(xiàn)，氨肽酶Aminopeptidase N(APN1和APN3)為甜菜夜蛾Cry1Ac殺蟲蛋白的結(jié)合蛋白，鑒定得到的結(jié)合蛋白種類為后續(xù)研究甜菜夜蛾Cry1Ac殺蟲蛋白受體提供理論基礎(chǔ)。此外，通過蛋白質(zhì)異源競爭結(jié)合研究發(fā)現(xiàn)，Cry1Ac和Cry2Aa殺蟲蛋白在甜菜夜蛾中腸Brush Border Membrane Vesicl

4、es(BBMVs)中沒有競爭性結(jié)合，說明甜菜夜蛾對(duì)Cry1Ac和Cry2Aa殺蟲蛋白不會(huì)產(chǎn)生交互抗性。
　　2.甜菜夜蛾APNs作為Cry1Ac殺蟲蛋白受體的研究
　　利用RNA干擾技術(shù)沉默已知的甜菜夜蛾APN基因(APN1、APN2、APN3、APN4、APN5、APN6)。結(jié)果顯示:取食了靶標(biāo)基因dsRNA48h后的甜菜夜蛾幼蟲APNs基因的表達(dá)量均顯著降低;甜菜夜蛾毒理實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，只有沉默了APN1基因的甜菜夜蛾幼蟲

5、對(duì)Cry殺蟲蛋白的敏感性下降。上述結(jié)果說明，APN1為甜菜夜蛾Cry1Ac潛在的功能受體。
　　3.甜菜夜蛾中腸Cry2Aa結(jié)合蛋白的鑒定
　　利用蛋白質(zhì)雙向電泳成功分離了甜菜夜蛾中腸BBMV總蛋白，配體雜交鑒定到7個(gè)蛋白點(diǎn)為甜菜夜蛾中腸Cry2Aa殺蟲蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。蛋白質(zhì)譜鑒定發(fā)現(xiàn)，這些結(jié)合蛋白分別為Polycalin、V-ATPase subunit A/B、RACK、4-HB-CoaT和Actin。這是首次通過甜菜夜

6、蛾中腸BBMV研究Cry2Aa殺蟲蛋白的作用機(jī)制。
　　4.甜菜夜蛾Cry2Aa殺蟲蛋白的受體功能分析
　　基于Cry2Aa結(jié)合蛋白的種類，通過原核表達(dá)成功獲得了Cry2Aa殺蟲蛋白的結(jié)合蛋白。競爭性ELISA結(jié)合實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，殺蟲蛋白能夠與體外獲得的靶蛋白結(jié)合，但是每個(gè)靶蛋白與Cry2Aa的結(jié)合能力不相同。此外，利用RNA干擾技術(shù)沉默結(jié)合蛋白基因后發(fā)現(xiàn)，沉默了V-ATPase subunitB基因的甜菜夜蛾幼蟲對(duì)Cry2Aa殺