鱗翅目昆蟲Cry毒素受體與人類的同名蛋白的生物信息學(xué)分析及Cry2Aa蛋白的果蠅表達(dá)體系構(gòu)建.pdf

1、第一部分鱗翅目昆蟲Cry毒素受體與人類的同名蛋白的生物信息學(xué)分析
　　背景：
　　Cry毒素是蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis, Bt)產(chǎn)生的一種殺蟲晶體蛋白，已廣泛應(yīng)用于鱗翅目、雙翅目、鞘翅目、膜翅目等害蟲的生物防治。Cry毒素的殺蟲機(jī)制主要包括細(xì)胞穿孔模型和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞凋亡模型，雖然兩種模型仍有爭(zhēng)議，但Cry毒素受體在兩種模型中都具有重要的作用[1,2,3]。Cry毒素受體主要有氨肽酶 N（a

2、minopeptidase-N, APN）[4]、類鈣黏蛋白（Cadherin-like protein, CaLP）[5]、堿性磷酸酶(alkaline-phosphatase, ALP)[6]和糖脂類[7]。人體同樣存在APN、CaLP、ALP三種蛋白，其與鱗翅目昆蟲Cry毒素受體的異同以及是否具有Cry毒素受體的功能至今鮮見報(bào)道。利用生物信息學(xué)技術(shù)分析鱗翅目昆蟲Cry毒素受體APN、CaLP、ALP與人類的同名蛋白之間的關(guān)系，有利

3、于探討人體內(nèi)是否存在 Cry毒素受體或類似物，為評(píng)價(jià)Cry毒素的安全性提供理論依據(jù)。
　　目的：
　　分析鱗翅目昆蟲Cry毒素受體氨肽酶N(APN)、類鈣黏蛋白(CaLP)、堿性磷酸酶(ALP)與人類的同名蛋白之間的關(guān)系，探討人體內(nèi)是否存在Cry毒素受體或類似物。
　　方法：
　　從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲取人類和鱗翅目昆蟲的APN、CaLP、ALP的氨基酸序列，利用Clustalx1.83、Clustal Omega、

4、MEGA6.0、InterPro、SWISS-MODEL及FATCAT等軟件和在線服務(wù)器對(duì)序列一致性、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、結(jié)構(gòu)域、三維結(jié)構(gòu)相似性等進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。
　　結(jié)果：
　　APN系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最近的是人類與家蠶，兩者序列一致性最高58.06％、含2個(gè)相同的結(jié)構(gòu)域、三維結(jié)構(gòu)相似性顯著（62.80%，P﹤0.05），且兩者都含有潛在的O糖基化和N糖基化位點(diǎn)。ALP系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最近的是人類與家蠶，兩者序列一致性最高46.03%、含

5、2個(gè)相同的結(jié)構(gòu)域、三維結(jié)構(gòu)相似性顯著（59.63%和59.59%，P﹤0.05）。人類與鱗翅目昆蟲的CaLP系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系較遠(yuǎn)；CaLP序列一致性最高是人類與棉鈴蟲（28.12%），兩者含2個(gè)相同的結(jié)構(gòu)域、三維結(jié)構(gòu)相似性不顯著（18.75%， P﹥0.05）。
　　結(jié)論：
　　人類和家蠶的APN、ALP系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最近、序列一致性最高、含有相同的結(jié)構(gòu)域且三維結(jié)構(gòu)相似性顯著；人類與家蠶的APN均含有潛在的O糖基化和N糖基化位點(diǎn)。

6、因此，預(yù)測(cè)人類的APN、ALP與家蠶的APN、ALP可能具有相似的生物學(xué)功能。由于家蠶的APN、ALP具有Cry毒素受體的生物學(xué)功能，因此推測(cè)人類的APN、ALP也可能具有類似Cry毒素受體的功能，但仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。
　　第二部 Cry2Aa蛋白的果蠅表達(dá)體系構(gòu)建
　　背景：
　　蘇云金芽孢桿菌產(chǎn)生的 Cry蛋白對(duì)鱗翅目、鞘翅目等昆蟲具有殺蟲活性，因而被作為有效的生物殺蟲劑廣泛應(yīng)用于農(nóng)林業(yè)害蟲的防治。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)

7、的發(fā)展， Cry蛋白在抗蟲轉(zhuǎn)基因作物的應(yīng)用也越來(lái)越多，目前國(guó)內(nèi)外已成功培育出轉(zhuǎn)基因玉米、水稻、油菜、棉花等多種抗蟲轉(zhuǎn)基因作物。由于外源基因的插入可能會(huì)引起次級(jí)效應(yīng)和位置效應(yīng)，因此轉(zhuǎn)基因作物可能存在一些潛在的風(fēng)險(xiǎn)。目前，轉(zhuǎn)基因作物的食用安全性和生態(tài)安全性越來(lái)越受關(guān)注。其中，轉(zhuǎn)基因作物的過(guò)敏原性評(píng)價(jià)是研究重點(diǎn)之一，而獲得一定量的外源蛋白是進(jìn)行過(guò)敏原性評(píng)價(jià)的基礎(chǔ)。另外，我們已經(jīng)通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)人類的APN和ALP可能具有類似Cry毒素受體的

8、功能，進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證需要 Cry蛋白作為實(shí)驗(yàn)材料。果蠅表達(dá)系統(tǒng)結(jié)合了昆蟲表達(dá)系統(tǒng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)，減少內(nèi)毒素的影響，能夠直接產(chǎn)生高效且穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白的昆蟲細(xì)胞系，具有較好的應(yīng)用前景。
　　目的：
　　將Cry2Aa基因克隆進(jìn)果蠅表達(dá)載體pAc5.1/V5-His中，構(gòu)建Cry2Aa-pAc5.1瞬時(shí)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒。另外，在Cry2Aa基因的5’端添加一個(gè)帽子結(jié)構(gòu)和Kozak序列從而獲得C2A33目的基因，并將其克隆

9、進(jìn)果蠅表達(dá)載體pMK33/pMtHy中，構(gòu)建C2A33-pMK33穩(wěn)定轉(zhuǎn)染質(zhì)粒。將這兩種重組質(zhì)粒分別采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)入果蠅S2細(xì)胞，從而構(gòu)建Cry2Aa蛋白的果蠅表達(dá)體系。表達(dá)的Cry2Aa蛋白可作為評(píng)價(jià)Cry2Aa蛋白過(guò)敏原性及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證人類的APN和ALP是否具有Cry毒素受體功能的實(shí)驗(yàn)材料。
　　方法：
　　1、根據(jù)Cry2Aa基因序列和實(shí)驗(yàn)要求設(shè)計(jì)PCR引物，由鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司合成。
　

10、　2、PCR擴(kuò)增獲得Cry2Aa目的基因，將其克隆進(jìn)pEASY–Blunt Simple Cloning Vector并進(jìn)行菌落PCR和雙酶切鑒定；將鑒定正確的目的基因克隆進(jìn)果蠅表達(dá)載體pAc5.1/V5-His中，構(gòu)建Cry2Aa-pAc5.1瞬時(shí)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，進(jìn)行菌落PCR、雙酶切和測(cè)序鑒定。
　　3、PCR擴(kuò)增獲得C2A33目的基因，將其克隆進(jìn)pEASY–Blunt Simple Cloning Vector并進(jìn)行菌落 PCR和

11、雙酶切鑒定；將鑒定正確的目的基因克隆進(jìn)果蠅表達(dá)載體pMK33/pMtHy中，構(gòu)建C2A33-pMK33穩(wěn)定轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，進(jìn)行菌落PCR、雙酶切和測(cè)序鑒定。
　　結(jié)果：
　　1、構(gòu)建了Cry2Aa蛋白的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒Cry2Aa-pAc5.1。
　　2、構(gòu)建了Cry2Aa蛋白的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染質(zhì)粒C2A33-pMK33。
　　結(jié)論：
　　本研究構(gòu)建了 Cry2Aa蛋白的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒 Cry2Aa-pAc5.1和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染質(zhì)粒