重組人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-16在大腸桿菌中的表達(dá)與純化及其生物學(xué)活性研究.pdf

1、目的：利用大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)重組人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-16(rhFGF16)，通過(guò)優(yōu)化表達(dá)以及純化條件，獲得可溶和包涵體兩種表達(dá)形式的高純度及高活性的重組hFGF16蛋白，并建立hFGF16蛋白的生物學(xué)活性檢測(cè)方法。此外，在細(xì)胞分子層面研究hFGF16蛋白促進(jìn)H460 cells的增殖作用及其增殖的發(fā)生機(jī)制。
　　方法：從Gene Bank中篩選目的基因人FGF16，進(jìn)行大腸桿菌偏好性?xún)?yōu)化后并合成基因FGF16，經(jīng)質(zhì)粒擴(kuò)增后與表達(dá)載

2、體pET-3d進(jìn)行雙酶切連接，構(gòu)建新的重組子 pET-3d-hFGF16。重組子經(jīng)雙酶切和基因測(cè)序鑒定后，轉(zhuǎn)化至 E.coli BL21(DE3) pLysS感受態(tài)細(xì)胞中制備表達(dá)工程菌株，通過(guò)篩選以獲得穩(wěn)定性高的表達(dá)量較高的工程菌。通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵工藝參數(shù)，調(diào)節(jié)目的蛋白的可溶性表達(dá)以及包涵體表達(dá)，其中包涵體部分經(jīng)6M鹽酸胍變性后經(jīng)一步逐滴稀釋至0M鹽酸胍緩沖液中，離心并收集沉淀，沉淀部分再次經(jīng)8M脲進(jìn)行變性，然后透析至4M脲緩沖液中，再依次

3、稀釋至2M脲緩沖液-0M脲緩沖液中，離心收集上清即為可溶蛋白?；趆FGF16蛋白等電點(diǎn)以及肝素親和性，建立了可溶性與包涵體兩種表達(dá)形式蛋白的純化方法。重組蛋白hFGF16經(jīng)SDS-PAGE聯(lián)合Western blot鑒定后，利用MTT法檢測(cè)重組蛋白hFGF16對(duì)NIH3T3細(xì)胞的促增殖活性。基于亞家族成員FGF9能促進(jìn)胚胎時(shí)期肺的發(fā)育以及肺支氣管的分化和肺相關(guān)癌癥的進(jìn)程，建立了利用MTT法檢測(cè)hFGF16促進(jìn)H460 cells增殖的

4、作用，同時(shí)通過(guò)Western blot篩選相關(guān)增殖信號(hào)通路，其中對(duì)經(jīng)典的促細(xì)胞增殖的信號(hào)通路Akt以及 MAPK信號(hào)通路進(jìn)行了驗(yàn)證，并進(jìn)一步引入了該信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白的抑制劑組分，通過(guò)MTT結(jié)合Western blot的檢測(cè)方法確定了hFGF16的促增殖作用機(jī)制。
　　結(jié)果：經(jīng)大腸桿菌表達(dá)偏好性?xún)?yōu)化的目的基因成功地導(dǎo)入至表達(dá)載體pET-3d中并構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-3d-hFGF16，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3

5、) pLysS表達(dá)菌株中。通過(guò)優(yōu)化表達(dá)條件成功獲得可溶性和包涵體兩種表達(dá)形式的蛋白，包涵體部分經(jīng)過(guò)兩次變性和復(fù)性處理獲得可溶蛋白，兩種存在于上清中的hFGF16蛋白，經(jīng)陽(yáng)離子交換層析柱和肝素親和層析柱純化得到的蛋白純度＞95％，其中可溶性形式蛋白收率約為130 mg/g，包涵體形式蛋白收率約為240 mg/g。細(xì)胞活性檢測(cè)證實(shí)，純化的重組蛋白能顯著地促進(jìn)NIH3T3細(xì)胞的增殖，在3 ng/mL～100 ng/mL之間呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性，且兩

6、種形式表達(dá)蛋白無(wú)明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，hFGF16能促進(jìn)NCl-H460 Cells的增殖并通過(guò)激活關(guān)鍵蛋白Akt和Erk1/2以及p38 MAPK的磷酸化來(lái)促進(jìn)NCl-H460 cells的增殖作用。
　　結(jié)論：成功構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pET-3d-hFGF16以及在E.coliBL21(DE3) pLysS中成功表達(dá)了具有高生物學(xué)活性和高純度的rhFGF16蛋白，并建立了可溶及包涵體兩種表達(dá)形式蛋白的純化方法及利用NI