Robo2調(diào)控小鼠腎臟和輸尿管發(fā)育的研究.pdf

1、背景：
　　 腎臟的發(fā)育是一個復(fù)雜過程，需要輸尿管芽(UB)和后腎間充質(zhì)(MM)兩種細(xì)胞群精確的相互作用來完成的。某一環(huán)節(jié)出現(xiàn)錯誤會導(dǎo)致腎臟發(fā)育不良、膀胱輸尿管反流等嚴(yán)重的腎臟和尿道發(fā)育異常。Robo2通過其配體Slit2在腎臟發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。Robo2/Slit2基因缺失可以導(dǎo)致調(diào)節(jié)腎臟發(fā)育的主要因素Gdnf的表達(dá)異常，從而使腎臟和輸尿管發(fā)育異常，引起多個腎臟、多個輸尿管和輸尿管擴(kuò)張改變。但是目前對于Robo2調(diào)控腎臟

2、和輸尿管發(fā)育的研究仍比較缺少，主要是對腎臟發(fā)育初期Robo2/Slit2基因敲除導(dǎo)致輸尿管芽萌出異常的研究，缺乏Robo2對腎臟發(fā)育后期的影響以及Robo2基因缺失導(dǎo)致腎臟和輸尿管發(fā)育異常的機(jī)制研究。目的：
　　 通過觀察和分析Robo2在腎臟發(fā)育過程中的表達(dá)變化、體外過表達(dá)Robo2對腎臟發(fā)育的影響、Robo2基因敲除對小鼠腎臟和輸尿管發(fā)育的影響等現(xiàn)象，揭示Robo2在腎臟和輸尿管發(fā)育過程中的作用及其機(jī)制。方法：
　　

3、 (1)顯微分離胚齡E12.5d、E13.5d、E14.5d、E15.5d、E16.5d、E17.5d、E18.5d胎鼠腎臟和生后日齡P1d、P1w、P4w小鼠腎臟，石蠟切片進(jìn)行PAS染色系統(tǒng)觀察小鼠腎臟發(fā)育各階段的形態(tài)學(xué)變化特點(diǎn)；應(yīng)用實(shí)時定量RT-PCR技術(shù)對腎臟組織中Robo2 mRNA水平表達(dá)進(jìn)行半相對定量分析；應(yīng)用免疫熒光技術(shù)檢測小鼠腎臟發(fā)育過程中Robo2蛋白水平的表達(dá)部位。
　　 (2)顯微分離胚齡E12.5d小鼠胚

4、胎腎組織，應(yīng)用顯微注射及電轉(zhuǎn)染方法，進(jìn)行表達(dá)載體顯微注射、轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)分為三組，正常對照組、空載體組、轉(zhuǎn)染GFP-Robo2組。將體外轉(zhuǎn)染的胚腎置于Transwell膜上，以氣液交界面的方式培養(yǎng)3天后，進(jìn)行腎小球和輸尿管芽標(biāo)志物(WT1、E-cadherin)和細(xì)胞增殖和凋亡(PH3、TUNEL)免疫熒光染色，觀察輸尿管芽分支、腎小球數(shù)目及后腎間充質(zhì)細(xì)胞增殖、凋亡變化情況。
　　 (3)取野生型胚齡E13.5d和E14.5d小鼠胚

5、胎輸尿管膀胱組織，應(yīng)用免疫熒光染色和實(shí)時定量RT-PCR的方法檢測Robo2在輸尿管、膀胱和中腎管(WD)的表達(dá)情況；應(yīng)用組織PAS染色和免疫熒光染色的方法，觀察Robo2基因敲除小鼠胚胎腎臟和輸尿管發(fā)育異常的情況。
　　 (4)取野生型胚齡E12.5d小鼠胚胎腎臟、輸尿管和膀胱組織，分別進(jìn)行分離培養(yǎng)，分為正常培養(yǎng)組、去腎組、去膀胱組和去腎去膀胱組，共4組，每組10個，于Transwell氣液交界面上培養(yǎng)6天后，進(jìn)行E-cadh

6、erin和α-SMA免疫熒光染色，觀察各組輸尿管長度的變化情況；并且應(yīng)用顯微注射和電轉(zhuǎn)染的方法，對野生型E12.5d胚胎的膀胱三角區(qū)進(jìn)行GFP-RNAiRobo2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，體外培養(yǎng)6天后進(jìn)行E-cadherin和α-SMA免疫熒光染色，觀察輸尿管長度的變化情況。
　　 (5)取同窩E13.5d Robo2基因敲除野生型和純合子胚胎，冰凍包埋連續(xù)切片，TUNEL染色觀察CND(common nephric duct)凋亡情況。

7、r>　　 結(jié)果：
　　 (1)腎臟發(fā)育過程中不同時間點(diǎn)的形態(tài)特征：①小鼠腎臟發(fā)育各階段PAS染色結(jié)果顯示，UB于E11.5d開始分支，E15.5d可見到初步形成的腎盂、腎盞；E16.5d有發(fā)育成熟的集合管、腎盂、腎盞；②MM在整個后腎發(fā)育階段圍繞UB呈“帽”狀分布；E13.5d UB周圍的MM聚集成團(tuán)，可見逗號形體、S形體；E14.5d出現(xiàn)腎小囊腔；E15.5d出現(xiàn)發(fā)育成熟的腎小球；E16.5d可見發(fā)育成熟的腎單位(腎小球、近

8、端小管、遠(yuǎn)端小管等)；出生后1.5d至1w腎小球數(shù)目繼續(xù)增多；出生后2w腎臟發(fā)育成熟。
　　 (2)腎臟發(fā)育過程中Robo2的表達(dá)變化：①實(shí)時定量RT-PCR結(jié)果顯示，Robo2在發(fā)育的E12.5d～E14.5d表達(dá)水平最高，隨后水平明顯下降，在出生后維持在低水平表達(dá)。②免疫熒光染色結(jié)果顯示，Robo2最初表達(dá)在胚腎的后腎間充質(zhì)，而不在輸尿管芽表達(dá)。隨著胚胎腎臟發(fā)育，Robo2表達(dá)于后腎間充質(zhì)細(xì)胞膜、圍繞輸尿管芽的濃縮帽狀間充質(zhì)

9、、逗號形體和“S”形體以及毛細(xì)血管袢，最終表達(dá)于腎小球足細(xì)胞。另外，部分早期腎小管上皮細(xì)胞也有微弱Robo2表達(dá)。
　　 (3)過表達(dá)Robo2對腎臟發(fā)育的影響：①輸尿管芽標(biāo)志物E-cadherin和腎小球標(biāo)志物WT1免疫熒光染色顯示，正常對照組、轉(zhuǎn)染空載體組腎臟輸尿管芽分枝和腎小球數(shù)目無明顯異常；而轉(zhuǎn)染GFP-Robo2組的輸尿管芽分枝減少，腎小球數(shù)目減少(p<0.05)。②與對照組相比，過表達(dá)Robo2組出現(xiàn)后腎間充質(zhì)減少，

10、輸尿管芽頂端缺少聚集的帽狀間充質(zhì)。③與正常對照組和轉(zhuǎn)染空載體組比較，過表達(dá)Robo2組腎臟后腎間充質(zhì)細(xì)胞凋亡情況未見明顯異常(p>0.05)，并且E-cadherin染色顯示輸尿管芽上皮細(xì)胞形態(tài)及排列無異常。
　　 (4)Robo2基因敲除對小鼠腎臟和輸尿管發(fā)育的影響：①免疫熒光染色顯示Robo2表達(dá)在膀胱三角區(qū)的疏松結(jié)締組織、CND和輸尿管；實(shí)時定量RT-PCR顯示，Robo2在輸尿管、膀胱、腦、肺組織中均有不同程度的表達(dá)，在

11、膀胱和輸尿管的含量多于肺組織但少于腦組織的含量。②與同窩野生型小鼠比較，Robo2基因敲除小鼠表現(xiàn)為腎臟明顯變小，有多個腎臟、多個輸尿管，輸尿管縮短，輸尿管積水和輸尿管與膀胱連接異常。
　　 (5)輸尿管發(fā)育的影響因素及Robo2影響輸尿管發(fā)育的可能機(jī)制：①野生型E12.5d小鼠胚胎腎臟、輸尿管和膀胱組織體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，與正常培養(yǎng)組相比，去腎組輸尿管長度延長無明顯差異(p>0.05)，去膀胱組和去腎去膀胱組輸尿管長度延長明顯變短(

12、p<0.05)。②在膀胱三角區(qū)轉(zhuǎn)染GFP-RNAiRobo2質(zhì)粒后，與正常培養(yǎng)組相比，輸尿管長度延長無明顯異常(p>0.05)。③Robo2基因敲除純合子小鼠膀胱三角區(qū)的CND末端可見到凋亡，但異常部位的CND無凋亡。
　　 結(jié)論：
　　 Robo2在腎臟和輸尿管中發(fā)育過程中均有表達(dá)，對腎臟和輸尿管的發(fā)育有重要作用；Robo2體外過表達(dá)可以導(dǎo)致腎臟輸尿管芽減少，后腎間充質(zhì)聚集減少等異常；體內(nèi)Robo2基因敲除可以引起輸尿