5-溴漢防己甲素與漢防己甲素逆轉(zhuǎn)K562-A02細(xì)胞多藥耐藥性的比較研究.pdf

1、目的：5-溴漢防己甲素是中草藥提取的雙芐基異喹啉生物堿-粉防己堿(漢防己甲素)的溴化產(chǎn)物,具有逆轉(zhuǎn)P-糖蛋白介導(dǎo)的腫瘤多藥耐藥(MDR)作用。本課題旨在研究比較BrTet與傳統(tǒng)中藥Tet對(duì)人慢性粒細(xì)胞白血病急性紅白血病變細(xì)胞株K562/A02多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)作用,并測(cè)定編碼P糖蛋白(P-gp)的多藥耐藥基因(MDR1)mRNA的表達(dá)水平,以探討它們逆轉(zhuǎn)MDR的作用機(jī)理,為BrTet作為耐藥逆轉(zhuǎn)劑的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。 方法：(1

2、)采用甲基四唑藍(lán)法(MTT)法檢測(cè)阿霉素(adfiamycin,ADM),BrTet,Tet單獨(dú)作用于K562/A02細(xì)胞和K562細(xì)胞時(shí)對(duì)細(xì)胞的增殖影響,分別計(jì)算出其半數(shù)抑制量(50％ Inhibiting Concentration,IC50)。(2)采用MTT法檢測(cè)ADM聯(lián)合應(yīng)用BrTet、Tet時(shí),對(duì)K562/A02細(xì)胞和K562細(xì)胞增殖影響的變化,并計(jì)算IC50及逆轉(zhuǎn)倍數(shù)(Fold Reversal,FR)。(3)采用流式細(xì)胞

3、儀(Flow Cytometry,FCM)檢測(cè)K562細(xì)胞、K562/A02細(xì)胞凋亡率以及細(xì)胞內(nèi)ADM濃度。(4)采用流式細(xì)胞儀和Western blot法檢測(cè)K562細(xì)胞、K562/A02細(xì)胞P-gp的表達(dá)。(5)采用半定量PCR(RT-PCR)測(cè)定細(xì)胞MDR1基因mRNA表達(dá)水平；(6)建立裸小鼠皮下移植瘤模型,比較BrTet、Tet在體內(nèi)的耐藥逆轉(zhuǎn)作用。 結(jié)果：(1)ADM聯(lián)合BrTet,Tet對(duì)K562細(xì)胞和K562/A

4、02細(xì)胞的毒性作用：①K562/A02、K562細(xì)胞對(duì)ADM的IC50值分別為(57.43±4.55)mg/L和(1.164±0.05)mg/L,K562/A02對(duì)ADM的耐藥倍數(shù)為49.51倍；②1.5 μmol/L及更低濃度的BrTet或Tet對(duì)K562細(xì)胞和K562/A02細(xì)胞均無明顯細(xì)胞毒作用,其抑制率均小于10％；③加入1.0 μmol/L的Tet后,K562/A02細(xì)胞對(duì)ADM的耐藥倍數(shù)為12.17倍。加入0.25μmol/

5、L、0.5 μmol/L和1.0 μmol/L的BrTet后,K562/A02細(xì)胞對(duì)ADM的耐藥倍數(shù)分別為17.88、9.9和4.24倍。(2)K562/A02細(xì)胞48小時(shí)凋亡率為(2.20±0.04)％；ADM單獨(dú)作用于K562/A02細(xì)胞48小時(shí)凋亡率為(2.69±0.05)％,0.25μmol/L、0.5 μmol/L、1.0 μmol/L的BrTet以及1.0 μmol/L的Tet聯(lián)合ADM作用于K562/A02細(xì)胞48小時(shí)后,

6、凋亡率分別為(22.63±0.87)％,(29.40±0.70)％,(61.43±0.85)％和(19.10±1.20)％。(3)流式測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ADM藥物濃度(與凋亡干預(yù)條件相同)①10mg/L ADM作用于K562/A02細(xì)胞2小時(shí)后細(xì)胞內(nèi)ADM平均熒光強(qiáng)度為82;②K562/A02經(jīng)Tet(1.0/μmol/L)或BrTet(1.0μmol/L)干預(yù)48小時(shí)細(xì)胞內(nèi)ADM平均熒光強(qiáng)度分別為313和418,與單用ADM組相比分別提高了5

7、1.6％和69.O％的ADM濃度。(4)流式測(cè)定K562/A02細(xì)胞膜P-gp的陽性率為97.97％。BrTet(1.0μmol/L)及Tet(1.0μmol/L)作用于K562/A02細(xì)胞48小時(shí)后P-gp的陽性率分別為：54.86％,81.18％。(5)Western blot法檢測(cè)對(duì)照組K562/A02細(xì)胞P-gp條帶與β-action的灰度比值為0.815±0.034。經(jīng)BrTet(1.0μmol/L)及Tet(1.0μmol/

8、L)作用48小時(shí)后,相應(yīng)的P-gp條帶與β-action的灰度比值分別為0.340±0.017和0.417±0.023,P-gP蛋白表達(dá)下調(diào)分別為51.11％和41.73％。(6)RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞MDRlmRNA的表達(dá)：①K562細(xì)胞MDRImRNA表達(dá)為陰性,K562/A02細(xì)胞MDRl mRNA表達(dá)為陽性；②K562/A02細(xì)胞的空白對(duì)照組,1.0μMBrTet組,0.5μM BrTet組,0.25μM BrTet組,1.0μM

9、 Tet組MDRl/β-action分別為0.985±0.104,0.321±0.047,0.542±0.164,0.696±0.237,0.498±0.168。(7)單獨(dú)應(yīng)用ADM對(duì)于K562/A02裸小鼠皮下移植瘤的抑制率為3.51％,腹腔給藥10 mg/kg BrTet以及Tet后,對(duì)于抑制率的抑制率分別為51.26％和10.55％。 結(jié)論：(1)BeTet可下調(diào)耐藥細(xì)胞表面P-gP的表達(dá)、促進(jìn)ADM進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),提高細(xì)胞內(nèi)