手足裂畸形和遺傳性骨病的基因診斷和產(chǎn)前診斷.pdf

1、本研究包括兩個部分：一是對兩個中國人手足裂畸形家系進行遺傳學致病機制的研究，確定致病基因位點，揭示手足裂畸形發(fā)病的細胞分子遺傳基礎，為患者及其家系成員提供遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷服務。二是對三種遺傳性骨病進行致病基因突變位點的檢出，為疾病的基因診斷、產(chǎn)前診斷及致病機制的研究奠定基礎。
　　第一部分手足裂畸形（split hand—foot malformation，SHFM）是由于四肢端骨正中軸的發(fā)育不良而剩余指(趾)呈不同模式的融合導

2、致的肢端畸形。
　　目的：對兩個中國人手足裂畸形家系，進行遺傳學的研究，確定致病基因位點，揭示手足裂畸形發(fā)病的細胞分子遺傳基礎，為患者及其家系成員提供遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷服務。
　　方法:采集了家系1和家系2患者及配偶外周血和羊水標本各兩份，一份外周血和羊水標本進行常規(guī)細胞培養(yǎng)，行傳統(tǒng)的染色體G顯帶核型分析。另一份外周血和羊水標本用QIAGEN試劑盒提取基因組DNA，送美國耶魯大學行微陣列比較基因組雜交(array-based

3、 comparative genomic hybridization，Array-CGH)。
　　結果：兩家系共4份外周血及2份羊水標本：家系1(I:1)(I:2)和家系2(I:1)(I:2)4份外周血染色體G顯帶核型分析未見異常。家系1(Ⅱ:3)羊水標本G顯帶核型分析未見異常。家系2(Ⅱ:1)羊水標本G顯帶核型分析示：46，XN,del(7)(q21q22.1)；微陣列比較基因組雜交（Array-CGH)分析結果：家系1(I:2

4、)外周血標本及羊水標本均示：662.3Kb dup（10q24.31-q24.32）。家系2(I:2)外周血標本未見異常。家系2(Ⅱ:1)羊水標本示：19.97Mb del(7q11.23-q21.3)。
　　結論：1.微陣列比較基因組雜交(Array-CGH)具有高通量和高準確性等特點，能夠檢測傳統(tǒng)核型分析無法檢測到的亞顯微拷貝數(shù)變異(copy number variations，CNVs)。Array—CGH技術在診斷不平衡染

5、色體畸變方面具有其他分子生物學技術無法比擬的優(yōu)越性，是傳統(tǒng)的 G顯帶核型分析技術的得力補充。2.明確662.3Kb dup（10q24.31-q24.32）和19.97Mb del(7q11.23-q21.3)是這兩個手足裂畸形家系的致病原因。并向兩個家系提供了準確的遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷服務，并成功實施了產(chǎn)前診斷，避免了患兒的出生。
　　第二部分遺傳性骨病是一類臨床表型多樣和遺傳異質(zhì)性較強的骨軟骨發(fā)育不良疾病，臨床表現(xiàn)包括身材矮小，

6、不成比例生長，畸形及單個或一組骨骼發(fā)育不良。本研究對遲發(fā)性脊椎骨骺發(fā)育不良(spondyloepiphyseal dysplasia tarda，SEDT，MIM271600)、多發(fā)性骨骺發(fā)育不良（multiple epiphyseal dysplasia，MED，MIM132400）、軟骨發(fā)育不良(hypochondroplasia，HCH，MIM14600)三種遺傳性骨病家系分別進行研究，在臨床診斷的基礎上，檢測致病基因，進行致病基

7、因突變位點的檢出，為疾病的基因診斷、產(chǎn)前診斷、及致病機制的研究奠定基礎。
　　第一節(jié) X連鎖遲發(fā)性脊柱骨骺發(fā)育不良基因基因診斷
　　目的：確定一個X-連鎖遲發(fā)性脊椎骨骺發(fā)育不良(X-linked spondyloepiphyseal dysplasia tarda，SEDT)家系的基因突變類型。
　　方法：首先應用體格檢查、影像學檢查和家系分析對該家系進行臨床診斷。其次用酚-氯仿法從該家系3代12名成員的外周血中提取基

8、因組DNA，針對SEDL基因的第3-6外顯子及其側翼序列設計4對引物，經(jīng)聚合酶鏈反應(PCR)和一代DNA測序（Sanger測序），對基因片段進行DNA序列分析查找突變位點。第三：用AMV-逆轉錄試劑盒提取患者及攜帶者的外周血RNA，逆轉錄成cDNA，經(jīng)PCR和Sanger測序，闡明該突變對mRNA轉錄水平上的影響。
　　結果:：基因組 DNA經(jīng) PCR及測序后證實：該家系中的患者均存在(c.IVS3+5G>C)突變，為突變半合子

9、；攜帶者為(c.IVS3+5G>C)突變雜合子。患者的 cDNA水平測序結果顯示 mRNA缺失了 Exon3序列，而攜帶者和正常人 mRNA中存在 Exon3序列。
　　結論：該 SEDT家系的致病突變是 SEDL基因(c.IVS3+5G>C)突變，該突變使轉錄水平上 mRNA的 Exon3缺失，進而導致 Sedlin蛋白無表達或表達減少。
　　第二節(jié)多發(fā)性骨骺發(fā)育不良的基因診斷
　　目的：對一多發(fā)性骨髓發(fā)育不良（ME

10、D）女性患者進行軟骨寡聚基質(zhì)蛋白（COMP）基因突變分析。
　　方法：采集病人及正常人血樣，提取 DNA，用外顯子序列捕獲+第二代測序技術對 COMP基因進行基因突變檢測并用 PCR結合 Sanger DNA測序法對突變位點進行驗證。
　　結果：該患者 COMP基因外顯子9處存在 c.956A＞T點突變。
　　結論：1.該患者發(fā)病是由 COMP基因 c.956A＞T突變導致，其 COMP基因第319位密碼子由原來編碼天

11、冬氨酸的密碼子 GAC突變?yōu)榫幋a纈氨酸的密碼子 GTC，該突變國內(nèi)外未見報道，為一新突變。2.外顯子序列捕獲+第二代測序方法，能夠在一次試驗中對多種基因進行檢測，相比第一代測序方法（Sanger法），具有大規(guī)模、高通量、穩(wěn)定性好、準確度高（靈敏度99％、特異性99%）和時效性高等一系列優(yōu)點。
　　第三節(jié)軟骨發(fā)育不良的基因診斷和產(chǎn)前診斷
　　目的：對一軟骨發(fā)育不良（HCH）家系進行軟纖維細胞生長因子受體3（FGFR3）基因進行

12、突變分析。
　　方法：采集患者、患者胎兒及正常人血樣，提取 DNA，用外顯子序列捕獲+第二代測序技術對 FGFR3基因進行基因突變的檢測并用 PCR結合 Sanger法進行突變位點驗證。
　　結果：患者及其胎兒均存在 FGFR3基因 c.1024G＞T突變。
　　結論：該患者及其胎兒患有 HCH，是由 FGFR3基因 c.1024G＞T突變所致。該突變使密碼子由 GGC轉變?yōu)?TGC，第342位的氨基酸由半胱氨酸替代了