狐貍源偽狂犬病毒HB1株的分離鑒定及生物學特性分析.pdf

1、偽狂犬病(pseudorabies，PR)是偽狂犬病毒引起的多種家畜和野生動物的一種急性傳染病。偽狂犬病病毒(pseudorabies virus，PRV)屬皰疹病毒科水痘病毒屬豬皰疹病毒Ⅰ型。PRV的宿主感染譜非常廣泛，能感染絕大多數(shù)的哺乳動物，包括豬、牛、羊、狗、貓、兔、狐貍、水貂和貉等動物。2011年以來，PRV變異毒株在中國中東部地區(qū)廣泛流行，給養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展帶來了非常大的影響。PRV是影響狐貍養(yǎng)殖業(yè)的重要的病毒性病原之一，狐貍P

2、R的主要臨床癥狀為神經(jīng)系統(tǒng)癥狀和呼吸道癥狀。目前暫無狐貍專用的PRV疫苗，其防控形勢嚴峻。本研究從發(fā)生PR的狐貍場，分離鑒定狐貍源PRV流行毒株，并對其進行生物學特性的研究，揭示了狐貍PR的發(fā)生和流行特征，為其有效的防控奠定基礎。
　　本研究從河北地區(qū)采集到疑似感染PRV死亡狐貍病料，組織病料經(jīng)研磨處理后，提取組織的病毒DNA，進行PRV的PCR檢測，PCR結果為PRV陽性。將病料接種PK15細胞傳代培養(yǎng)，PK15細胞出現(xiàn)典型的P

3、RV CPE變化。通過噬斑純化，獲得了狐貍源PRV分離株純化病毒。間接免疫熒光試驗結果表明，該PRV分離株可與PRV Bartha K-61株和PRV HeN1株的陽性血清發(fā)生特異性反應，產(chǎn)生特異性熒光，將該分離株命名為PRVHB1株。HB1株的的透射電子顯微鏡觀察結果顯示，病毒近似圓球形，直徑約為150-180 nm，符合皰疹病毒粒子的形態(tài)。
　　HB1株可感染PK15等12種細胞，但在不同細胞的CPE變化和增殖特性不同，以微量

4、法測得HB1株在PK15細胞上的滴度為10767TCID50/mL。一步生長曲線表明，HB1株與Bartha K-61株和SC株具有相似的生長動力學，且HB1株在PK15細胞上的滴度最高。中和試驗結果表明，Bartha K-61陽性血清和HeN1陽性血清能夠中和HB1株的最高稀釋度分別為8倍和32倍，HeN1變異株的抗血清能夠完全中和HB1株，而Bartha K-61疫苗株的抗血清不能完全中和HB1株。以96對引物對HB1株進行基因組的

5、分段測序，最終共得到HB1株的52個基因的序列，遺傳演化分析表明，HB1株屬于PRV基因Ⅱ型，HB1 gE基因與Becker和Kaplan株的同源性為97.9％，與HBCL和TJ等國內(nèi)分離株的同源性均達到99％以上;與歐美等國外參考毒株相比，HB1株gE基因編碼的氨基酸序列共存在19個替換和2個插入。HB1 gC基因與Bartha、Becker、Kaplan和SC株的同源性為96.2％，與HBCL、HLJ8和JS-2012等國內(nèi)變異株的

6、同源性均達到99.5％以上;與歐美等國外參考毒株相比，HB1 gC基因編碼的氨基酸序列共存在27個替換，及在第63-69位存在一個AAASTPA的連續(xù)7個氨基酸插入，這與國內(nèi)近年來豬群流行的變異株的特征一致。
　　以10467、10567、10667和10767 TCID50/mL的HB1株分別接種BALB/c小鼠，小鼠可表現(xiàn)瘙癢和呼吸困難等典型臨床癥狀和腦多量少突膠質細胞增生和肺泡壁增厚等病理變化。10767TCID50/mL感