嘌呤信號在結(jié)腸癌中的殺傷機制研究.pdf

1、背景目的：
　　 嘌呤信號主要由三部分組成:①細胞外核苷酸，細胞外微環(huán)境的重要成分;②核苷酸水解酶(如CD39即ENTPD1，二三磷酸核苷酸水解酶-1)，通過將核苷酸水解為核苷來調(diào)節(jié)細胞應(yīng)答;③核苷酸及衍生物作用的特異性受體。三磷酸腺苷(ATP)不僅在細胞能量代謝過程中發(fā)揮著重要作用。最近有研究發(fā)現(xiàn)，細胞外ATP作為一種新的危險信號，通過作用于2型嘌呤受體(P2)激活細胞內(nèi)的信號級聯(lián)反應(yīng)，參與機體內(nèi)諸多病理生理過程，如細胞增殖，

2、分化，凋亡，炎癥反應(yīng)和代謝等。P2受體可以識別ATP和其他的三磷酸和二磷酸核苷，其家族分為7個離子通道型P2X受體(P2X1-7)和8個G蛋白偶聯(lián)P2Y受體(P2Y1，2，4.6，11-14)兩種類型。不同的P2受體對不同的激動劑具有不同的親和力和特異性，可據(jù)此調(diào)節(jié)細胞功能。
　　 高濃度的細胞外ATP通過多種分子機制發(fā)揮其抗腫瘤活性?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)ATP不僅能促進抗腫瘤免疫反應(yīng)，而且對多種腫瘤細胞有直接的細胞毒性。在15種P2受體亞

3、型中，有五種直接參與ATP的腫瘤殺傷作用，分別是P2X5，P2X7，P2Y1，P2Y2，P2Y11。然而這些嘌呤受體介導(dǎo)的腫瘤細胞殺傷的確切分子機制尚不明確。
　　 哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路處于細胞功能的調(diào)控中心，在細胞生長中處于核心地位。在人類腫瘤中，經(jīng)常發(fā)生mTOR信號通路的過度激活或突變。mTOR信號傳導(dǎo)通路活化可以抑制細胞凋亡，促進細胞周期進展，促進細胞的增殖，并參與血管生成，參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。細胞

4、內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路非常復(fù)雜，抑制信號通路中某個成分，常常破壞關(guān)鍵的負反饋機制，以致其他代償通路被激活。因此，充分認識嘌呤信號的復(fù)雜性（包括負反饋調(diào)節(jié)回路），以及明確ATP-嘌呤受體誘導(dǎo)的細胞毒性信號通路的下游組成，將有助于明確抑制信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中某特定分子后可能的生物學后果，為腫瘤的治療尋找新的途徑。
　　 材料方法：
　　 1.實驗動物與細胞培養(yǎng)
　　 2.結(jié)腸癌細胞MCA38和黑色素瘤細胞B16/F10體外增殖及活

5、性檢測:CCK-8和原位成像流式細胞儀分析
　　 3.xCELLigenceRTCAMP儀器實時動態(tài)監(jiān)測細胞生長
　　 4.克隆形成實驗觀察MCA38腫瘤細胞克隆形成情況
　　 5.拮抗劑或激動劑（嘌呤受體、Ca2+及選擇性細胞信號通路）與MCA38和B16/F10腫瘤細胞共培養(yǎng)，檢測細胞體外增殖/活性，及分析蛋白表達情況
　　 6.蛋白質(zhì)提取與蛋白印記分析
　　 7.提取RNA，進行RT-PCR

6、
　　 8.慢病毒P2X7shRNA構(gòu)建P2X7基因沉默的穩(wěn)定的MCA38和B16/F10腫瘤細胞株
　　 9.溴化乙錠攝取實驗觀察細胞表面孔洞的形成
　　 10.通過高效液相色譜法(HPLC)測定細胞內(nèi)核苷酸水平的變化
　　 11.C57BL/6雄性小鼠腫瘤種植取材
　　 12.統(tǒng)計學分析
　　 結(jié)果：
　　 1、ATP在體內(nèi)和體外具有抗腫瘤作用
　　 MCA38和B16

7、/F10兩種腫瘤細胞經(jīng)過細胞外高濃度ATP的短時間處理（15-30分鐘），細胞的活性和增殖被有效抑制，且呈時間和濃度依賴性。ATP的細胞毒性對腫瘤細胞的生物學功能有多方面的影響:在體外實驗中，表現(xiàn)為抑制細胞活性、增殖和克隆形成;在體內(nèi)實驗中，表現(xiàn)為抑制C57BL/6野生型小鼠中種植腫瘤的生長。通過xCELLigenceRTCAMP系統(tǒng)實時監(jiān)測腫瘤細胞生長，發(fā)現(xiàn)ATP對腫瘤細胞的細胞毒性是直接并且迅速的，并且這種細胞毒性作用來自于ATP，

8、而非其降解產(chǎn)物ADP或腺苷。即使被極高濃度的ADP或者腺苷(10mM)長時間干預(yù)，腫瘤細胞的生長也不受影響。此外，我們還發(fā)現(xiàn)胞外高濃度ATP能顯著誘導(dǎo)作為自噬敏感標志的LC3-Ⅱ表達，這種表達也呈時間和濃度依賴性。
　　 2、ATP對PI3K/AKT,AMPK和mTOR信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的影響
　　 我們首先檢測細胞外高濃度ATP對MCA38細胞和B16/F10細胞中mTOR、磷酸肌醇-3-激酶和蛋白激酶B(PI3K/AKT)

9、和AMP激酶(AMPK)信號傳導(dǎo)通路的影響。腫瘤細胞經(jīng)過細胞外高濃度ATP處理后，mTOR和PI3K/AKT信號通路中各分子的磷酸化水平降低，同時伴隨AMPK通路分子的活化。這種變化呈時間和濃度依賴性，且與細胞的生長狀態(tài)（完全培養(yǎng)基或無血清培養(yǎng)基）無關(guān)。
　　 為進一步明確ATP誘導(dǎo)的mTOR，PI3K/AKT和AMPK信號通路的改變情況，我們選用針對相應(yīng)信號通路分子的阻斷劑進行了以下實驗。我們選取S6K作為mTOR在活化或失活

10、狀態(tài)中變化的標志。首先，岡田酸(OA)是蛋白磷酸酶1(PP1)和蛋白磷酸酶2A(PP2A)的強效抑制劑，它可完全阻斷ATP介導(dǎo)的p-AKT的去磷酸化，而對傳統(tǒng)意義上的下游靶點分子量為40的富含脯氨酸的AKT底物（PRAS40）并沒有影響。OA也不能逆轉(zhuǎn)ATP對mTOR信號通路和對細胞生長的抑制。PI3K的抑制劑LY294002，幾乎可以完全阻斷AKT-PRAS40-S6K在基礎(chǔ)水平的磷酸化。與理論推斷一致，雷帕霉素抑制S6K磷酸化的程度

11、和ATP相似。表明生理條件下，在腫瘤細胞中PI3K/AKT-PRAS40是mTOR信號通路的上游。
　　 其次，復(fù)合物C(CC)是AMPK信號分子的抑制劑，我們用CC阻斷AMPK的活化可完全逆轉(zhuǎn)ATP引起的S6K磷酸化水平的降低。PRAS40是公認的AKT的下游靶點，和p-S6K相似，ATP引起的PRAS40的磷酸化水平的降低可完全被CC逆轉(zhuǎn)，表明AMPK-PRAS40-mTOR是一條新的ATP誘導(dǎo)腫瘤殺傷的信號通路。
　

12、　 最后，和ATP相似，雷帕霉素能顯著誘導(dǎo)腫瘤細胞中自噬分子LC3-Ⅱ的表達。而OA或CC能明顯降低LC3Ⅱ在基礎(chǔ)水平或ATP誘導(dǎo)情況下的表達，單獨OA或CC干預(yù)都無法逆轉(zhuǎn)ATP引起的細胞死亡。并且，單獨用CC干預(yù)腫瘤細胞可顯著抑制細胞生長(P=0.002)。此外，阻斷PI3K/AKT(LY294002)或者mTOR（雷帕霉素）兩條通路中的任意一條或兩條，都可誘導(dǎo)細胞死亡，但和ATP相比，引起細胞死亡的程度弱很多。
　　 3、

13、P2X7受體調(diào)控ATP誘導(dǎo)腫瘤細胞死亡
　　 通過RT-PCR分析MCA38細胞中P2受體家族mRNA的表達情況，MCA38細胞表達P2X3（最少），P2X4-5，P2X6（弱），P2X7，P2Y1，P2Y12-14。BzATP是特異性P2X7受體激動劑，隨后，我們用BzATP處理MCA38和B16/F10腫瘤細胞，發(fā)現(xiàn)BzATP抑制細胞生長，并且誘發(fā)細胞內(nèi)信號通路的改變，和ATP引起的改變完全一致。而P2X5，P2Y2，P2Y

14、4和P2Y6受體的激動劑UTP，對腫瘤細胞的生長無影響。此外，非特異性P2受體拮抗劑蘇拉明（Suramin，抑制P2X1-3，P2X5，P2Y1-2，P2Y6和P2Y11-13受體），可阻斷ATP誘導(dǎo)的AMPK信號通路的激活，但不能逆轉(zhuǎn)ATP對AKT、PRAS40和S6K磷酸化和對腫瘤細胞生長的抑制作用。同時，選擇性P2X7受體拮抗劑KN-62，可逆轉(zhuǎn)ATP介導(dǎo)的信號通路的改變，呈時間和濃度依賴性。
　　 4、P2X7基因沉默可

15、保護腫瘤細胞免受ATP的腫瘤殺傷作用
　　 我們應(yīng)用慢病毒P2X7shRNA轉(zhuǎn)染MCA38和B16/F10細胞，構(gòu)建穩(wěn)定的P2X7基因沉默的腫瘤細胞株。在四種P2X7shRNA中，其中一種幾乎完全阻斷了MCA38和B16/F10兩種腫瘤細胞中P2X7蛋白的表達。P2X7基因缺陷的腫瘤細胞幾乎完全逆轉(zhuǎn)了ATP在以下方面對腫瘤細胞的抑制作用:細胞信號傳導(dǎo)通路，細胞生長，克隆形成能力和細胞自噬。和對照細胞相比，P2X7基因沉默細胞具有

16、更強的增殖和克隆形成潛能。表明P2X7受體，至少是在很大程度上，將高水平的細胞外ATP信號傳遞至細胞內(nèi)，促進腫瘤細胞死亡。
　　 5、細胞外ATP誘導(dǎo)對P2X7受體通道功能的影響
　　 首先，通過RT-PCR檢測P2X7受體兩種剪切異構(gòu)體(splicevariant)的表達，發(fā)現(xiàn)在mRNA水平，MCA38細胞和B16/F10細胞都只表達P2X7(a)。其次，以溴化乙錠攝取實驗評估P2X7通道功能尤其是細胞表面孔洞的形成，

17、發(fā)現(xiàn)在兩種細胞中，胞外高濃度ATP能顯著刺激對溴化乙錠的攝取。第三，以HPLC方法測定胞外高濃度ATP處理腫瘤細胞后，細胞內(nèi)ATP,ADP和AMP的濃度的變化情況，發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)ATP濃度繼發(fā)性降低，同時伴隨ADP和AMP水平及AMP/ATP比率的顯著升高，以上發(fā)現(xiàn)和ATP-P2X7誘導(dǎo)AMPK信號通路激活的結(jié)果一致。第四，接下來通過應(yīng)用拮抗劑研究證實，P2X7受體激活導(dǎo)致PI3K/AKT和AMPK/mTOR信號通路的改變，與原始孔洞形成轉(zhuǎn)

18、載蛋白（包括pannexin-或connexin-類型的通道）以及活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）無關(guān)。生胃酮（CBX，pannexin-或connexin-類型的藥理學抑制劑）和N-乙酰半胱氨酸(NAC，廣譜抗氧化劑)對ATP誘導(dǎo)的P2X7信號通路級聯(lián)反應(yīng)都無影響。
　　 最后，我們發(fā)現(xiàn)P2X7受體激活可導(dǎo)致腫瘤細胞自噬，特異性藥理學抑制劑（如Z-VAD-fmk，細胞凋亡蛋白酶抑制劑，或凋亡特異

19、性抑制劑Necrostatin-1）都不能逆轉(zhuǎn)ATP誘導(dǎo)的腫瘤細胞死亡。
　　 6、Ca2+信號和ATP-P2X7介導(dǎo)的腫瘤殺傷活性無關(guān)
　　 我們選取了兩種改變細胞內(nèi)Ca2+水平的化學藥物進行了以下實驗。BAPTA-AM和毒胡蘿卜素(TG)，BAPTA-AM是選擇性細胞通透的鈣離子螯合劑，可降低細胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度;毒胡蘿卜素(TG)，是高效的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+-ATP酶抑制劑，能導(dǎo)致細胞質(zhì)內(nèi)Ca2+水平迅速升高。我們發(fā)現(xiàn)B

20、APTA-AM不能逆轉(zhuǎn)ATP誘導(dǎo)的mTOR信號通路的抑制和LC3-Ⅱ水平的增加，但可以完全阻斷PI3K/AKT和mTOR通路以及LC-3Ⅱ在基礎(chǔ)水平的激活，對AMPK信號通路沒有影響，同時也可顯著誘導(dǎo)細胞死亡。TG可激活A(yù)MPK信號通路，但是對PI3K/AKT和mTOR通路及細胞自噬無影響。
　　 結(jié)論：
　　 1、細胞外高濃度ATP可直接抑制細胞增殖，并可誘導(dǎo)細胞自噬引起腫瘤細胞死亡，且呈時間和濃度依賴性;
　　

21、 2、ATP介導(dǎo)的細胞毒性通過激活兩條獨立的信號傳導(dǎo)途徑實現(xiàn)，分別是AMPK-PRAS40-mTOR和PI3K/AKT信號通路;
　　 3、P2X7受體是ATP介導(dǎo)的信號通路上游調(diào)控的關(guān)鍵分子，ATP-P2X7誘導(dǎo)腫瘤細胞死亡是通過細胞內(nèi)核苷酸外流誘導(dǎo)細胞凋亡和壞死實現(xiàn)的;
　　 4、生理條件下，一定濃度的Ca2+是腫瘤細胞生長必需的，與ATP誘導(dǎo)的細胞毒性無關(guān)。
　　 總之，我們推斷出高濃度的細胞外ATP通過