支持細(xì)胞模擬生物微環(huán)境對人臍帶華爾通氏膠源間充質(zhì)干細(xì)胞分化成男性生殖細(xì)胞的影響.pdf

1、【背景與目的】不孕不育影響越來越多的夫婦，現(xiàn)越來越多的臨床證據(jù)顯示不育的原因來自男性，大約占50％，這其中又有70%～90%是源于精子發(fā)生出現(xiàn)障礙，臨床表現(xiàn)為精子產(chǎn)生異常。生殖細(xì)胞缺陷所致的男性不育癥是目前臨床難于攻克的疾病，傳統(tǒng)輔助生殖技術(shù)尚無法從根本上解決此類病人的生育問題，精原干細(xì)胞移植是突破這一瓶頸的理想途徑。人臍帶華爾通氏膠來源的間充質(zhì)干細(xì)胞有很強的自我更新能力和多向分化潛能，能向三個胚層的細(xì)胞分化，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞是人類的

2、再生醫(yī)學(xué)工程上的種子細(xì)胞。我們的前期研究表明，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在新生小鼠睪丸細(xì)胞培養(yǎng)液、維甲酸及睪酮的誘導(dǎo)培養(yǎng)下，誘導(dǎo)第7天形態(tài)上開始變細(xì)變長，形成類似“蝌蚪樣”細(xì)胞，第3、7天表達生殖細(xì)胞標(biāo)記Oct4、Ckit、CD49f、Stella，第14天表達生殖細(xì)胞特異標(biāo)記Vasa；人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植至不育小鼠睪丸體內(nèi)，1個月后表達生殖細(xì)胞標(biāo)記Stella、Dazl，并且移植到不育小鼠體內(nèi)不發(fā)生排斥反應(yīng)，且可發(fā)生遷移并能存活至少120天

3、。但是誘導(dǎo)得到的細(xì)胞無法進一步誘導(dǎo)分化成為有功能的成熟的男性生殖細(xì)胞，而且全反式維甲酸、睪酮是人造的化學(xué)藥物添加劑。近幾年來，越來越多的證據(jù)顯示干細(xì)胞的定向分化與其所處微環(huán)境中的信號通路有關(guān)，環(huán)境中的信號調(diào)節(jié)系統(tǒng)通過與基因簇相互作用，決定了特定基因的表達。微環(huán)境中的信號很多，可以概括為兩類：一是化學(xué)信號分子，一是物理信號。據(jù)文獻報道，在干細(xì)胞的定向分化研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞間的相互接觸是一關(guān)鍵因素，為干細(xì)胞分化提供電、機械刺激及各種化學(xué)信號分子

4、。睪丸支持細(xì)胞對于男性生殖細(xì)胞的發(fā)生、成熟有著至關(guān)重要的作用。于是我們提出了這樣一個設(shè)想：人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞與睪丸支持細(xì)胞間的互相作用可能可以誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞獲得男性生殖細(xì)胞的特性，體外分離培養(yǎng)睪丸支持細(xì)胞作為飼養(yǎng)層，模擬男性睪丸微環(huán)境誘導(dǎo)，提供人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化所需的細(xì)胞因子、營養(yǎng)成分等，對人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在支持細(xì)胞是否存在“環(huán)境依賴性分化”的特性，以及生物誘導(dǎo)分化的效果進行研究。
　　【材料與方法】采用差異貼壁

5、法分離、培養(yǎng)、擴增出人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，從新生昆明小鼠的睪丸中分離培養(yǎng)出睪丸支持細(xì)胞，制備支持細(xì)胞飼養(yǎng)層，將人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞加入支持細(xì)胞飼養(yǎng)層中共培養(yǎng)，顯微鏡觀察誘導(dǎo)前后細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化；RT-PCR、細(xì)胞免疫熒光、westblot檢測男性生殖細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記的表達。
　　【結(jié)果】模擬一種有效的“睪丸微環(huán)境”對人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞進行誘導(dǎo)，利用人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞與睪丸支持細(xì)胞飼養(yǎng)層直接接觸，隨著共培養(yǎng)后，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞逐漸失去細(xì)小

6、成纖維樣的形狀，形成類似精原細(xì)胞樣的圓形細(xì)胞菌落，圓形緊密團簇精原細(xì)胞樣在28天后形成，誘導(dǎo)7天、14天、21天后，RT-PCR、細(xì)胞免疫熒光、westblot均可以檢測到男性生殖細(xì)胞特異性標(biāo)記VASA、DAZL及stella的表達。
　　【結(jié)論】在睪丸支持細(xì)胞模擬的睪丸微環(huán)境，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞不僅發(fā)生形態(tài)學(xué)的變化，而且能表達生殖細(xì)胞的特異生物學(xué)特性，表明在特定的微環(huán)境中，細(xì)胞與細(xì)胞間的相互接觸是微環(huán)境中控制人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向