microRNA介導(dǎo)Wnt通路抑制A549肺癌細(xì)胞球增殖能力的研究.pdf

1、目前在世界范圍內(nèi),肺癌是威脅公共健康的主要原因之一。研究發(fā)現(xiàn)肺癌高死亡率主要是化療僅能殺滅對化療藥物敏感的腫瘤細(xì)胞,而無法有效殺滅天然耐藥或通過突變獲得耐藥能力的一類亞群腫瘤細(xì)胞,使得腫瘤出現(xiàn)復(fù)發(fā)和耐藥,最終導(dǎo)致治療的失敗。近年來的研究證實(shí)這一類亞群腫瘤細(xì)胞不僅具有耐藥的能力,還具有自我更新、再生等干細(xì)胞特性,故被稱為腫瘤干/祖細(xì)胞(cancer stem/initiating cell)。目前尋找基因靶點(diǎn),有效殺滅腫瘤干細(xì)胞已成為腫瘤

2、治療的主要關(guān)注點(diǎn)之一。
　　microRNAs(miRNAs)是一種內(nèi)源性的、含有18-25個核苷酸的單鏈非編碼RNA,其主要通過與特定靶mRNA的3’端UTR的互補(bǔ)(包括完全性和非完全性),抑制靶mRNA的翻譯或促進(jìn)靶mRNA的降解,從而發(fā)揮調(diào)控作用。由于其具有一個miRNA可作用于多個靶點(diǎn)的獨(dú)特作用,因此通常miRNA影響靶點(diǎn)的表達(dá)以及靶點(diǎn)相關(guān)的信號通路使其發(fā)揮的效應(yīng)進(jìn)一步放大。目前研究發(fā)現(xiàn)miRNA在維持細(xì)胞正常機(jī)能方面發(fā)揮

3、著重要的作用,當(dāng)miRNA的表達(dá)或結(jié)構(gòu)發(fā)生異常時,可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。
　　Wnt家族蛋白是一種分泌型富含半胱氨酸的糖蛋白,包括19種高度保守的蛋白。Wnt蛋白在細(xì)胞發(fā)育以及調(diào)控細(xì)胞生理功能,如細(xì)胞增殖、分化、凋亡、黏附、遷移和極性等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Wnt蛋白的調(diào)節(jié)異?？蓪?dǎo)致發(fā)育、增殖和血管發(fā)生的異常,最終可引起腫瘤的發(fā)生。近年的研究證實(shí),Wnt信號通路在腫瘤的生長、侵襲中發(fā)揮著重要作用。
　　大量證據(jù)表明miRNA表達(dá)的

4、改變通過影響其介導(dǎo)的包括Wnt/β-catenin經(jīng)典信號通路在內(nèi)的多條與腫瘤發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的信號通路。但對于miRNA是否能調(diào)控Wnt信號通路對腫瘤干細(xì)胞增殖的影響尚不清楚。因此,本研究旨在探討調(diào)控肺癌干細(xì)胞的候選miRNA,并驗(yàn)證其通過干擾Wnt信號通路對肺癌干細(xì)胞的增殖產(chǎn)生影響,以期為肺癌干細(xì)胞的靶向治療提供理論基礎(chǔ)。
　　研究目的:
　　1.研究Wnt蛋白對富含CD133+CD44+的A549細(xì)胞球增殖的調(diào)控作用;<

5、br>　　2.篩選腫瘤組織與癌旁組織中差異表達(dá)的miRNA;
　　3.探討miRNA介導(dǎo)的Wnt信號通路對A549細(xì)胞球增殖的調(diào)控作用。
　　材料和方法:
　　實(shí)驗(yàn)材料:
　　肺腺癌組織以及癌旁組織由南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院心胸外科提供,腺癌A549細(xì)胞株由南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸科提供。
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　1.普通A549細(xì)胞、293T細(xì)胞和A549細(xì)胞球的培養(yǎng);
　　2.質(zhì)粒的擴(kuò)增和提取;

6、r>　　3.病毒的包裝、純化與濃縮;
　　4.Wnt5a RNAi、Wnt2 RNAi以及miR-4686和miR-21抑制物的轉(zhuǎn)染;
　　5.流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞CD133、CD44的表達(dá);
　　6.MTT法檢測細(xì)胞增殖抑制率;
　　7.Western blot檢測Wnt5a、Wnt2、DKK2和β-catenin蛋白的表達(dá);
　　8.微列陣芯片檢測肺癌組織的miRNA異常表達(dá)譜;
　　9.RT-P

7、CR檢測miRNA-4686、miR-21、Wnt5a、Wnt2和β-catenin基因的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.Wnt5a、Wnt2蛋白、miR-4686和miR-21在A549細(xì)胞球中的表達(dá)高于A549細(xì)胞(P<0.05);
　　2.RNA干擾Wnt5a和Wnt2蛋白表達(dá)可抑制A549細(xì)胞球增殖能力(P<0.05);
　　3.抑制A549細(xì)胞球中miR-21表達(dá)后,其DKK2蛋白表達(dá)上調(diào),β-cateni

8、n蛋白表達(dá)下調(diào)、細(xì)胞增殖能力減低(P<0.05);
　　4.肺癌組織中miR-4686等27個miRNA表達(dá)較癌旁組織中的表達(dá)上調(diào)(P<0.05),肺癌組織中有6個miRNA的表達(dá)較癌旁組織中的表達(dá)下調(diào)(P<0.05);
　　5.抑制A549細(xì)胞球中miR-4686表達(dá)后,其Wnt5a、Wnt2和β-catenin的mRNA和蛋白表達(dá)下調(diào)、細(xì)胞增殖能力減低(P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.Wnt蛋白參與調(diào)控