stx1-Istx2+產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌O157-H7分離株85m-1-2VT1噬菌體的初步分析及其stx2、eaeA和hlyA基因的致病作用.pdf

1、目前，產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌（Shiga toxin-producing Escherichia coli，STEC）引起的暴發(fā)流行和散發(fā)病例在世界范圍內(nèi)時(shí)有報(bào)道，已成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。STEC不僅能引起人類腹瀉，還可引起嚴(yán)重的出血性腸炎(hemorrhagic colitis，HC)和溶血性尿毒癥(haemolytic uraemic syndrome，HUS)。尤其是腸出血性大腸桿菌(enterohemorrhageEscheric

2、hia coli，EHEC)O157∶H7菌株在報(bào)道的感染中占主導(dǎo)地位，目前非O157 STEC感染的病例也在增加。
　　近年來，EHEC O157∶H7毒力基因的結(jié)構(gòu)、功能及其調(diào)節(jié)基因的作用研究取得了突破性進(jìn)展。已經(jīng)完成了四個(gè)O157∶H7分離株的全基因組測序工作。其中EDL933W為標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株，包含主要毒力基因:染色體上原噬菌體編碼的志賀毒素基因（stx）、LEE致病島上決定A/E表型的基因（eaeA）和質(zhì)粒編碼的腸溶血素基因

3、（hlyA）。志賀毒素，是STEC最重要的毒力因子，是造成人類HC和HUS的主要原因，包含Stx1和Stx2兩個(gè)亞型，其編碼基因由噬菌體分別插入到基因組內(nèi)的不同位置。O157∶H7 EDL933W標(biāo)準(zhǔn)株同時(shí)含有這兩個(gè)亞型的毒素，而本實(shí)驗(yàn)室分離的強(qiáng)毒株STEC O157∶H785m-1-2缺少Stx1亞型，僅含有Stx2亞型。
　　本研究通過對分離株85m-1-2的VT1噬菌體基因進(jìn)行了初步分析，發(fā)現(xiàn)該分離株含有VT1噬菌體，且其插

4、入位點(diǎn)與Nurmohammad等報(bào)道的大多數(shù)STEC O157∶H7菌株相同，存在于yehV基因內(nèi)部;且噬菌體左右兩端與基因組連接處的基因序列與GenBank中已公布的相應(yīng)基因序列高度同源。通過對該噬菌體基因內(nèi)stx1基因所在位置的上下游基因進(jìn)行擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)stx1基因?yàn)閱为?dú)缺失，其上下游基因保持完整，且與EDL933株基因組內(nèi)相應(yīng)基因具有較高的同源性。
　　eaeA、stx2和hlyA基因是STEC致病的主要毒力基因，其致病作用在

5、stx1+/stx2+E.coliO157∶H7株中研究較多，但在stx1-/stx2+E.coli O157∶H7中的致病作用尚未見報(bào)道。本文運(yùn)用同源重組方法成功地構(gòu)建了這三個(gè)基因的單突變株85mΔeaeA、85mΔstx2、85mΔhlyA和三突變株85mΔeaeAΔstx2ΔhlyA。將含stx2完整閱讀框及其上下游啟動(dòng)子的質(zhì)粒pGEX-6P-1-stx2電轉(zhuǎn)化突變株85mΔstx2和85mΔeaeAΔstx2ΔhlyA，獲得回復(fù)

6、株Re85mΔstx2和Re85mΔeaeAΔstx2ΔhlyA。RT-PCR結(jié)果表明，各基因突變株的缺失只影響突變基因本身的轉(zhuǎn)錄，其上下游基因并未受到影響。
　　對野生株、突變株和回復(fù)株生物學(xué)特性進(jìn)行了研究。生長曲線測定結(jié)果顯示，各突變株的生長速度與野生株85m-1-2沒有明顯差異;Hep-2細(xì)胞粘附試驗(yàn)結(jié)果顯示，野生株85m-1-2對該細(xì)胞成大量彌散型粘附，突變株85mΔeaeA和85mΔeaeAΔstx2ΔhlyA對細(xì)胞仍有

7、粘附作用，但粘附能力減弱，呈散在局灶性粘附;Vero細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果顯示，野生株和回復(fù)株的菌液上清在作用24 h內(nèi)即可使Veto產(chǎn)生病變，使之變圓、脫落，而突變株85mΔstx2和85mΔeaeAΔstx2ΔhlyA的菌液上清完全喪失對Veto細(xì)胞的毒性作用;溶血性試驗(yàn)表明，野生株在5％的綿羊血平板上會(huì)形成明顯的溶血圈，而突變株85mΔhlyA和85mΔeaeAΔstx2ΔhlyA不能;小鼠致死性試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離株85m-1-2(80

8、％)的致死率略低于EDL933(90％)，且死亡高峰稍有滯后，突變株85mΔeaeA的致死率(80％)同野生株一樣，但小鼠死亡高峰出現(xiàn)明顯滯后現(xiàn)象，突變株85mΔhlyA的致死率為70％，而兩個(gè)回復(fù)突變株Re85mΔstx2和Re85mΔeaeAΔstx2ΔhlyA的致死率均為100％，突變株85mΔstx2接種小鼠未見死亡，三基因突變株接種小鼠85mΔeaeAΔstx2ΔhlyA僅死亡一只。攻毒后小鼠排菌動(dòng)態(tài)監(jiān)測結(jié)果顯示，野生株85m

9、-1-2和EDL933組的小鼠排菌時(shí)間均可持續(xù)2周左右，突變株85mΔstx2為11d，85mΔhlyA為12d，85mΔeaeA和85mΔeaeAΔstx2ΔhlyA只能持續(xù)7d。組織學(xué)病理變化結(jié)果顯示，只有野生株85m-1-2組和EDL933對照組小鼠的組織器官有明顯的病變，而突變組小鼠病變不明顯。分離株85m-1-2組和EDL933對照組的小鼠都有明顯的腎組織病變，預(yù)示著分離株85m-1-2可能與人類發(fā)生HUS有關(guān)，其對人的致病性