大鼠急性腦缺血后CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、TGF-β1的表達(dá)及其相關(guān)性研究.pdf

1、缺血性腦卒中即為廣義的腦梗塞，是指突然發(fā)生的腦組織局部供血?jiǎng)用}血流灌注減少或血流完全中斷，停止供血、供氧、供糖等，使該局部腦組織崩解破壞。缺血性腦卒中成為當(dāng)今世界成年人死亡和致殘的主要原因之一，其高死亡率、高致殘率越來(lái)越受到人們關(guān)注。在眾多治療腦梗死的措施中，溶栓治療是唯一被認(rèn)為確切有效的辦法，但由于其治療時(shí)間窗較短和高出血風(fēng)險(xiǎn)，限制了其在臨床的運(yùn)用。研究發(fā)現(xiàn):在局灶性腦缺血后較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)腦損傷仍進(jìn)行性加重，腦缺血組織周邊存在明顯炎性免疫

2、反應(yīng)，其輕重與缺血后神經(jīng)損害程度密切相關(guān)。甚至Acalovschi等認(rèn)為:在腦缺血急性期，缺血區(qū)炎性反應(yīng)對(duì)腦組織的損傷要比缺血本身更為嚴(yán)重。另一種觀(guān)點(diǎn)指出，缺血性腦卒中后由于血-腦屏障破壞和組織破壞致使腦的抗原表位暴露給免疫系統(tǒng)，從而可造成自身免疫性損傷。有研究指出:提前誘導(dǎo)對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)抗原鞘磷脂堿蛋白(MBP)的免疫耐受可抑制神經(jīng)系統(tǒng)的自身免疫反應(yīng)，而且可以改善腦卒中結(jié)果。通常認(rèn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中“促炎反應(yīng)”具有神經(jīng)破壞作用，而“抑炎反應(yīng)

3、”具有神經(jīng)保護(hù)作用。抑制腦缺血后的“炎性免疫反應(yīng)”或“自身免疫反應(yīng)”可能會(huì)成為今后治療和改善急性腦缺血損傷的重要靶點(diǎn)，然而目前關(guān)于腦缺血后炎性免疫反應(yīng)的機(jī)制尚未完全闡明，特別是急性腦缺血后的“抑炎反應(yīng)”的研究目前仍較少，因此有必要對(duì)腦缺血后炎癥免疫反應(yīng)的調(diào)控機(jī)制行進(jìn)一步的探討。
　　 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg細(xì)胞)是一批具有獨(dú)特免疫調(diào)節(jié)功能的T細(xì)胞亞群，以調(diào)劑自身T細(xì)胞反應(yīng)為主要功能，此類(lèi)細(xì)胞同時(shí)具有免疫無(wú)能性和免疫抑制功能兩大特

4、征。它能夠抑制自身反應(yīng)性T細(xì)胞的表達(dá)、阻止自身免疫性疾病的發(fā)生、免疫無(wú)能、維持自身免疫耐受等，在維持外周免疫耐受和抑制炎癥反應(yīng)發(fā)生中具有不可替代的作用。其中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞為目前研究較為深入的Treg細(xì)胞，目前認(rèn)為該群細(xì)胞最具特異的標(biāo)志是叉頭翼螺旋轉(zhuǎn)錄因子Foxp3，其在CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的產(chǎn)生和功能發(fā)揮方面都起到?jīng)Q定性的作用。研究指出TGF-β1是有CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分泌產(chǎn)生的一種具有免疫抑制作用

5、的細(xì)胞因子，同時(shí)TGF-β1在誘導(dǎo)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的產(chǎn)生和維持作用的發(fā)揮中起關(guān)鍵作用。體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)高表達(dá)TGF-β1轉(zhuǎn)基因小鼠的外周血和胸腺中CD4+CD25+T細(xì)胞的表達(dá)增加，體外研究指出將TGF-β1與CD4+CD25+T細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)能增強(qiáng)CD4+CD25+T細(xì)胞的免疫抑制性功能。
　　 近年來(lái)Treg細(xì)胞已在自身免疫疾病、腫瘤、器官移植、病毒性感染等疾病領(lǐng)域中已經(jīng)展開(kāi)了廣泛的研究，尤其是CD4+CD25+

6、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞已經(jīng)成為目前研究的熱點(diǎn)話(huà)題。然而就目前國(guó)內(nèi)外研究狀況而言，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在缺血性腦卒中方面的的研究較少。已知腦缺血組織周邊存在明顯炎性反應(yīng)，是加重腦缺血損傷的原因之一。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是一種具有免疫抑制作用的細(xì)胞，那么CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是否參與急性腦缺血的發(fā)生發(fā)展？具體作用是什么目前仍不太清楚。研究已經(jīng)指出TGF-β1能誘導(dǎo)體內(nèi)外CD4+CD25+T細(xì)胞的表達(dá)及作用的發(fā)揮，那么在腦缺

7、血發(fā)生發(fā)展的病理演變過(guò)程中，TGF-β1是否同樣與CD4+CD25+T細(xì)胞的表達(dá)息息相關(guān)呢？
　　 目的:
　　 動(dòng)態(tài)觀(guān)察大鼠急性腦缺血后不同時(shí)期外周血中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和TGF-β1的表達(dá)情況，探討二者之間的相關(guān)性，觀(guān)察腦缺血灶病理形態(tài)學(xué)特征，同時(shí)觀(guān)察腦組織中Foxp3的表達(dá)與腦缺血灶形成的關(guān)系以及外周血中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表達(dá)與神經(jīng)功能損傷的相關(guān)性，以探討CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在急

8、性缺血性卒中病理生理演變過(guò)程中的作用以及調(diào)節(jié)通路。
　　 48只Wistar大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為腦缺血組和假手術(shù)組，每組各24只。參考改良的Zea-Longer插線(xiàn)方法將缺血組大鼠制作成右側(cè)大腦中動(dòng)脈線(xiàn)栓腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ?。分別采用流式細(xì)胞術(shù)和ELISA法檢測(cè)造模后1d、3d、7d、14d時(shí)大鼠外周血中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和TGF-β1的表達(dá)情況，采用HE染色觀(guān)察腦缺血灶病理形態(tài)學(xué)特征，采用免疫組化法觀(guān)察兩組大鼠腦組織中

9、Foxp3的表達(dá)，同時(shí)采用改良NSS神經(jīng)功能缺損評(píng)分觀(guān)察兩組大鼠行為學(xué)變化，并做CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與TGF-β1、NSS之間的相關(guān)分析。
　　 結(jié)果:
　　 1、流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，急性腦缺血后的1d、3d、7d、14dCD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表達(dá)有逐漸增高趨勢(shì)，在這4個(gè)時(shí)間點(diǎn)中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表達(dá)只有1d、3d差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，其它時(shí)間均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05

10、)。外周血中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表達(dá)在腦缺血后的1d、3d時(shí)與假手術(shù)組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，到7d、14d時(shí)其表達(dá)明顯高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 2、ELISA法結(jié)果顯示，外周血中TGF-β1的表達(dá)在腦缺血后的1d時(shí)與假手術(shù)組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，到3d時(shí)其表達(dá)開(kāi)始較假手術(shù)組增高(P＜0.05)，到7d、14d時(shí)其表達(dá)明顯高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)學(xué)意義(P

11、＜0.05);急性腦缺血后的1d、3d、7d、14dTGF-β1的表達(dá)同樣有逐漸增高趨勢(shì)，且各個(gè)時(shí)間點(diǎn)相互之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 3、HE染色顯示，缺血組大鼠腦組織可見(jiàn)梗死灶，呈典型的缺血性改變，神經(jīng)元胞體縮小，胞核固縮、深染，病變部位與周?chē)M織界線(xiàn)清楚，壞死中心區(qū)可見(jiàn)大量神經(jīng)細(xì)胞缺血壞死，神經(jīng)元外形不易辨認(rèn)，大部分細(xì)胞結(jié)構(gòu)消失，胞漿空泡樣變性，神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目明顯減少，壞死灶內(nèi)大量膠質(zhì)細(xì)胞增生。假手術(shù)組大鼠

12、腦組織中神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，未見(jiàn)明顯的病理性損傷。
　　 4、免疫組化染色結(jié)果顯示，在腦缺血后的1d、3d、7d、14d的腦組織中均可觀(guān)察到Foxp3的表達(dá)，且主要集中在缺血灶及周邊區(qū)域，在腦缺血組的未缺血區(qū)域也可以觀(guān)察到Foxp3的表達(dá)，而假手術(shù)組腦組織未形成缺血灶，未見(jiàn)Foxp3的表達(dá)。
　　 5、神經(jīng)功能評(píng)分結(jié)果顯示，兩組大鼠的神經(jīng)功能缺損評(píng)分差異在腦缺血后的1d、3d、7d、14d均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01

13、)。
　　 6、相關(guān)分析顯示，急性腦缺血后的1d、3d、7d、14dTGF-β1的表達(dá)逐漸增多，與CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.822，p=0.000);各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的相關(guān)分析顯示，除在腦缺血后1d時(shí)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與TGF-β1的表達(dá)無(wú)顯著相關(guān)之外，余各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均存在正相關(guān)關(guān)系:1d(r=0.9757，p=0.138)、3d(r=0.921,p=0.027)、7d(r=0.886,p=0.0

14、45)、14d(r=0.920,p=0.027);隨著腦缺血時(shí)間延長(zhǎng)，急性腦缺血后的神經(jīng)功能評(píng)分均逐漸下降，與CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.820，p=0.01)，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的相關(guān)分析顯示:CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表達(dá)與神經(jīng)功能缺損評(píng)分在腦缺血后的1d、3d、7d、14d均存在負(fù)相關(guān)關(guān)系:1d(r=-0.885，p=0.019)、3d(r=-0.878,p=0.022)、7d(r=-0.690,p=0.

15、029)、14d(r=-0.911,p=0.012)。
　　 結(jié)論:
　　 1、CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在急性腦缺血后的不同時(shí)期存在著動(dòng)態(tài)變化，提示CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞參與大鼠急性腦缺血后病理生理的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。
　　 2、腦缺血后可出現(xiàn)神經(jīng)元胞體縮小，胞核固縮、深染、大量神經(jīng)細(xì)胞缺血壞死，神經(jīng)元外形不易辨認(rèn)，大部分細(xì)胞結(jié)構(gòu)消失，胞漿空泡樣變性，神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目明顯減少，壞死灶內(nèi)大量膠質(zhì)細(xì)胞增生等現(xiàn)象

16、。
　　 3、腦組織中Foxp3的表達(dá)與腦缺血灶的形成密切相關(guān)，F(xiàn)oxp3的表達(dá)嚴(yán)格集中在梗塞灶及周邊區(qū)域，提示CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞參與腦組織的缺血損傷和修復(fù)過(guò)程。
　　 4、CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表達(dá)與神經(jīng)功能損傷程度呈負(fù)相關(guān)，提示CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在急性腦缺血后的免疫調(diào)節(jié)中可能具有保護(hù)作用。
　　 5、TGF-β1在急性腦缺血后的不同時(shí)期同樣存在著動(dòng)態(tài)變化，且與CD4+CD25