DMD基因診斷體系建立、應(yīng)用和羊水iPSCs構(gòu)建.pdf

1、假肥大型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥(Duchenne Muscular Dystrophy/Becker's MuscularDystrophy，DMD/BMD)是最常見的X-連鎖隱性致死性遺傳病之一，由Duchenne等（1868年）首先報(bào)道，故得其名。本病的群體發(fā)病率高達(dá)1/3500活產(chǎn)男嬰，是一種預(yù)后不良的常見的原發(fā)性肌肉疾病。典型的臨床特征是進(jìn)行性肌萎縮、肌無力伴小腿腓腸肌的假性肥大，通常累及青少年男性，一般在12歲以前喪失站立和行走的能力，

2、最后因心肌以及呼吸肌無力而多于20歲前死于心力衰竭或呼吸衰竭。本病嚴(yán)重影響了青少年男性的健康成長(zhǎng)，同時(shí)也給家庭和社會(huì)帶來了沉重的精神和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。
　　 本病基因定位在人類X染色體短臂Xp21上，DMD基因突變是本病各型臨床亞型患者發(fā)病的共同的分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)。DMD基因突變的主要形式有三類:缺失型突變、重復(fù)型突變和點(diǎn)突變，前兩種突變約占了全部基因突變的70％，點(diǎn)突變約占30％。而所有的突變中約70％遺傳自母親，約30％沒有家族史，

3、為新發(fā)突變。
　　 國(guó)內(nèi)外至今尚缺乏對(duì)于本病有效的治療措施，因此，對(duì)先證者進(jìn)行確診、對(duì)攜帶者進(jìn)行產(chǎn)前診斷以杜絕患兒出生的出生缺陷干預(yù)措施仍然是目前國(guó)內(nèi)外假肥大型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥遺傳優(yōu)生關(guān)鍵之所在。
　　 在基因診斷技術(shù)開展以前，本病的臨床診斷除依靠典型的癥狀和體征外，還需要結(jié)合肌電圖、酶生化檢查和肌肉活檢等輔助性檢查，其中肌電圖顯示肌源性損害及酶生化檢查發(fā)現(xiàn)肌酶活性顯著增高是較可靠的臨床診斷依據(jù)。但上述血清酶的增加特異性并不

4、高，并且存在假陽(yáng)性和假陰性，而且不能應(yīng)用在胎兒的產(chǎn)前診斷上，導(dǎo)致在臨床上應(yīng)用受到一定的限制。
　　 隨著DNA研究技術(shù)的發(fā)展，各種基因診斷的手段也被應(yīng)用到假肥大型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥的檢測(cè)中來。國(guó)外DMD基因診斷的主要手段有:Southern印跡雜交技術(shù)、DMD基因多重PCR技術(shù)、短串聯(lián)重復(fù)序列PCR技術(shù)及反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)。Chamberlain等設(shè)計(jì)了9對(duì)引物的多重PCR，可檢出80％的DMD基因缺失型患者;Beggs等增設(shè)了另外9對(duì)

5、引物多重PCR，這18對(duì)引物總共可以檢出98％的DMD基因缺失型患者。但這種方法的局限是不能檢測(cè)出基因缺失型和基因重復(fù)型的雜合子攜帶者。Prior等最先應(yīng)用定量PCR原理診斷了雜合子攜帶者。短串聯(lián)重復(fù)序列PCR技術(shù)也被用于非缺失型家系的基因連鎖分析。
　　 DMD產(chǎn)前基因診斷是一個(gè)比較復(fù)雜的難題，我們以前主要采用性別診斷、多重PCR缺失突變分析、STR單體型連鎖分析等方法進(jìn)行。這些方法有一定的局限性，不能很好地適應(yīng)產(chǎn)前診斷的需要

6、。單一的性別診斷會(huì)導(dǎo)致正常的男性胎兒被淘汰掉。由于存在高達(dá)11％的基因內(nèi)交換率，理論上STR單體型連鎖分析結(jié)果具有可高達(dá)11％假陽(yáng)性或假陰性率，因此，這種單體型連鎖分析診斷結(jié)果只是一種概率性診斷，有時(shí)也因缺乏先證者和雜合信息或家系過小而無法展開連鎖分析。多重PCR方法所得到的遺傳信息量不夠大，容易導(dǎo)致漏診，而且不能檢測(cè)出重復(fù)突變，也不能檢測(cè)出雜合子攜帶者。鑒于上述缺陷，建立各種DMD基因雜合子非概率性確診技術(shù)就成為最終解決DMD雜合子攜

7、帶者診斷的關(guān)鍵，是DMD產(chǎn)前基因診斷的前提條件。
　　 針對(duì)DMD基因三大類突變類型，我們擬建立高效、省時(shí)的針對(duì)DMD基因全部79個(gè)外顯子的缺失型、重復(fù)型和點(diǎn)突變型基因突變的檢測(cè)方法，對(duì)患者以及攜帶者作出正確的診斷，并將其應(yīng)用于產(chǎn)前診斷;探索產(chǎn)前診斷時(shí)機(jī)前移的可行性，以達(dá)到早期診斷、杜絕患胎出生、優(yōu)生優(yōu)育的目的。
　　 本研究應(yīng)用多重連接依賴性探針擴(kuò)增（Multiplex Ligation dependent Probe

8、Amplification，MLPA）等方法對(duì)DMD先證者及其母親進(jìn)行檢測(cè)，篩選出準(zhǔn)備生育下一胎的DMD攜帶者進(jìn)行產(chǎn)前基因診斷，檢測(cè)DMD全部79個(gè)外顯子的缺失型與重復(fù)型突變，建立準(zhǔn)確的DMD患者和雜合子攜帶者的基因診斷技術(shù);建立改良的96孔板一步全外顯子測(cè)序方法，用于點(diǎn)突變型DMD基因突變的檢測(cè)和產(chǎn)前診斷;摸索高分辨溶解曲線(High Resolution Melting，HRM)用于DMD突變的初篩方法;摸索單卵裂球的全基因組擴(kuò)增方

9、法，為下一步開展胚胎種植前遺傳學(xué)診斷和篩查(PGD/PGS)、囊胚優(yōu)化提供實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備;探討女性DMD患者的發(fā)病機(jī)理;建立羊水來源細(xì)胞誘導(dǎo)多能干細(xì)胞系(iPSCs)，為DMD的基因治療研究和疾病模型建立提供良好的研究基礎(chǔ)。
　　 第一章、缺失型和重復(fù)型DMD基因突變?cè)\斷技術(shù)的建立及其在產(chǎn)期診斷中的應(yīng)用研究
　　 目的：本部分的研究目的在于建立更準(zhǔn)確、高效、省時(shí)的基因診斷方法應(yīng)用于缺失型和重復(fù)型DMD基因突變的診斷和產(chǎn)前診斷。

10、
　　 建立適宜的實(shí)驗(yàn)方法篩查DMD全部79個(gè)外顯子的缺失與重復(fù)突變。建立準(zhǔn)確的DMD患者和雜合子攜帶者的基因診斷技術(shù)。在前期研究基礎(chǔ)上，篩選出準(zhǔn)備生育下一胎的DMD家系進(jìn)行產(chǎn)前基因診斷，避免以往正常的男性胎兒被無辜地淘汰掉的情況發(fā)生，建立一套臨床可行的DMD產(chǎn)前基因診斷方法。
　　 本章研究還探討早期產(chǎn)前診斷的方法與時(shí)機(jī)，盡量把檢測(cè)時(shí)機(jī)提早，從中期羊水檢查提早到早期絨毛的產(chǎn)前診斷，便于終止妊娠手術(shù)的提前，減輕孕婦的痛苦

11、，為出生缺陷的早期干預(yù)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 對(duì)單卵裂球進(jìn)行DNA全基因組擴(kuò)增，摸索可用于DMD胚胎種植前診斷的實(shí)驗(yàn)方法，為下一步開展胚胎種植前診斷和胚胎種植前遺傳學(xué)篩查、囊胚優(yōu)化提供實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備。
　　 方法：
　　 資料來源:
　　 1、病例主要來源于廣州醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院、中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院、廣州市兒童醫(yī)院和南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院，先證者均具有典型的DMD臨床表現(xiàn)，經(jīng)血清肌酶、肌電圖或肌組織活檢等檢查，排

12、除了其他神經(jīng)肌肉系統(tǒng)遺傳病;
　　 2、攜帶者妊娠期抽取羊水組織或絨毛組織:
　　 3、知情同意廢棄的卵裂期單細(xì)胞及已知基因型DMD患者的單淋巴細(xì)胞。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:
　　 1、應(yīng)用MLPA法對(duì)先證者進(jìn)行檢測(cè):采用SALSA probe mix P034和P035(MRC Holland)經(jīng)變性、雜交、連接反應(yīng)、PCR反應(yīng)和ABI3100遺傳分析儀毛細(xì)管電泳對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析，檢測(cè)DMD基因79個(gè)外顯子缺失

13、型以及重復(fù)型基因突變。
　　 2、篩選出155個(gè)有再生育要求，并且已明確攜帶了DMD基因雜合缺失或基因雜合重復(fù)的DMD攜帶者，對(duì)其風(fēng)險(xiǎn)胎兒進(jìn)行產(chǎn)前診斷:其中，對(duì)148例攜帶者孕婦于妊娠16周以后行羊膜腔穿刺術(shù)以獲得羊水樣本;7例攜帶者孕婦于妊娠9-12周左右行絨毛膜穿刺術(shù)抽取絨毛組織。
　　 3、絨毛組織檢查時(shí)同時(shí)抽取攜帶者孕婦血液，對(duì)絨毛樣本和母體樣本進(jìn)行DNA-STR分型。
　　 4、用RFPLI-g Mid

14、i對(duì)單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增(WGA)——多重置換擴(kuò)增(MDA)，并用PCR及DMD-STR位點(diǎn)擴(kuò)增進(jìn)行驗(yàn)證。
　　 結(jié)果：
　　 1、DMD先證者及其母親的基因診斷結(jié)果:對(duì)1119例臨床疑似DMD患者進(jìn)行了基因診斷，檢測(cè)出缺失型和重復(fù)型DMD患者共725例，其中DMD基因缺失突變607例，占54％(607/1119)，DMD基因重復(fù)突變118例，占11％(118/1119)，未發(fā)現(xiàn)缺失和重復(fù)的394例，占35％(394/11

15、19)。
　　 2、DMD先證者缺失突變和重復(fù)突變的突變來源比較:在607例基因缺失突變患者中，342例母親為缺失突變攜帶者，265例為新發(fā)突變，突變率為43.66％(265/607);在118例基因重復(fù)突變的患者中，96例母親為重復(fù)突變攜帶者，22例為新發(fā)突變，突變率為18.64％(22/118)。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，Pearson Chi-Square=25.846P＜0.001，兩種突變類型的來源有顯著性差異。
　　 3、

16、MLPA法與熒光多重PCR方法的比較:對(duì)55例MLPA方法檢測(cè)DMD基因缺失或重復(fù)的DNA樣本用熒光多重PCR(fmPCR)方法進(jìn)行檢測(cè)，可見55例中有4例用fmPCR檢不出的，而用MLPA方法能獲得79個(gè)外顯子全部信息，對(duì)基因的缺失與重復(fù)的檢測(cè)沒有出現(xiàn)漏診。
　　 4、缺失型和重復(fù)型DMD攜帶者產(chǎn)前診斷
　　 (1)產(chǎn)前診斷的結(jié)果:我們總共對(duì)155例診斷為缺失型或重復(fù)型攜帶者孕婦進(jìn)行了產(chǎn)前診斷，其中148例抽取中期妊娠

17、羊水、7例抽取早期妊娠絨毛組織。檢出DMD患胎27例，占17％(27/155);胎兒DMD攜帶者28例，占18％(28/155);正常胎兒100例，占65％(100/155)。對(duì)DMD患胎給予終止妊娠，正常胎兒及DMD攜帶者胎兒給予繼續(xù)妊娠的處理。
　　 (2)胎兒的性別情況:155例產(chǎn)前診斷胎兒中，男胎72例，女胎83例。在72例男胎中，27例為患胎，占全部男胎的38％(27/72)，45例為正常男胎，占63％(45/72);

18、在83例女胎中，28例胎兒為攜帶者，占女胎的34％(28/83);55例為正常女胎，占66％(55/83)。
　　 (3) DMD基因突變的類型:在檢出的27例患胎中，DMD外顯子缺失突變22例(14.19％，22/155);外顯子重復(fù)突變5例(3.23％，5/155);在檢出的28例胎兒DMD基因攜帶者中，雜合缺失突變25例(16.13％，25/155)，雜合重復(fù)突變3例(1.94％，3/155);正常胎兒100例，占64.5

19、2％。
　　 (4) DMD外顯子累計(jì)被缺失與重復(fù)突變涉及的次數(shù):本研究中DMD基因缺失和重復(fù)突變主要分布在外顯子45～52之間，為突變熱點(diǎn)區(qū)域，其中外顯子49突變發(fā)生次數(shù)最高，共22次;在本研究中外顯子1和2未發(fā)現(xiàn)突變，外顯子56～79之間的突變發(fā)生次數(shù)較低，絕大部分只涉及1次;外顯子73涉及過2次。
　　 5、早期妊娠絨毛組織DMD產(chǎn)前基因診斷:對(duì)7例攜帶者進(jìn)行了孕早期的DMD產(chǎn)前診斷:抽取早孕絨毛組織，用MLPA方

20、法進(jìn)行全外顯子的檢測(cè)，并對(duì)樣本及母體進(jìn)行DNA-STR分型以排除母源性污染?；蛟\斷結(jié)果:1例為DMDexon48-50基因缺失突變、胎兒DMD基因診斷明確為患兒，孕婦選擇終止妊娠;1例為DMD exon16-42雜合重復(fù)突變，胎兒DMD基因診斷明確為DMD攜帶者，給予繼續(xù)妊娠的處理;其余5例胎兒均正常。
　　 6、對(duì)8個(gè)單胚胎細(xì)胞進(jìn)行了全基因組多重置換擴(kuò)增(WGA-MDA)，并用PCR方法對(duì)DYS(Ⅱ)、DMD外顯子50、外顯

21、子49、外顯子12和外顯子17對(duì)MDA的擴(kuò)增效果進(jìn)行驗(yàn)證;并用DMD44、49、50 STR、DYS(Ⅱ) STR及3'CA STR進(jìn)行驗(yàn)證，均可得到預(yù)期結(jié)果。
　　 結(jié)論：
　　 1、MLPA方法是目前為止檢測(cè)DMD缺失型和重復(fù)型基因突變的最有效的方法，能鑒別突變是缺失型還是重復(fù)型，也能區(qū)分患者與攜帶者，可用于該類型患者的診斷及攜帶者的產(chǎn)前診斷。
　　 2、采用MLPA方法結(jié)合DNA-STR分型技術(shù)對(duì)絨毛組織進(jìn)

22、行檢測(cè)可用于DMD的孕早期診斷，有利于早期進(jìn)行出生缺陷干預(yù)。
　　 3、本研究DMD基因突變主要分布在外顯子45～52之間，其中外顯子49突變發(fā)生次數(shù)最高，為突變熱點(diǎn)區(qū)域。
　　 4、DMD外顯子缺失突變和重復(fù)突變的突變率有顯著性差異，后者多遺傳自母親，新發(fā)突變較少。
　　 5、已建立了單卵裂球全基因組擴(kuò)增-多重置換擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)方法，并通過了DMD外顯子的PCR和STR對(duì)其擴(kuò)增效果的驗(yàn)證，為下一步開展胚胎種植前診斷和

23、胚胎種植前遺傳學(xué)篩查、囊胚優(yōu)化提供實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備。
　　 第二章、點(diǎn)突變型DMD基因診斷與篩查技術(shù)的建立及應(yīng)用研究研究
　　 目的：通過上一章所建立的診斷技術(shù)流程，已經(jīng)可以解決基因的缺失突變和基因重復(fù)突變這兩類的患者診斷、攜帶者診斷及其產(chǎn)前診斷問題，也就是解決了約70％的DMD診斷問題。而剩下的約30％患者是由DMD基因的點(diǎn)突變引起，MLPA無法檢測(cè)點(diǎn)突變。由于DMD基因的龐大，目前我國(guó)還沒有醫(yī)療機(jī)構(gòu)能常規(guī)地對(duì)DMD基因點(diǎn)突變

24、的患者進(jìn)行檢測(cè)，因而也沒辦法對(duì)點(diǎn)突變的家系進(jìn)行產(chǎn)前診斷。
　　 針對(duì)DMD如此龐大的基因，本研究擬建立更高效的全外顯子測(cè)序方法檢測(cè)其點(diǎn)突變，在一塊96孔板上加樣，經(jīng)一次的測(cè)序流程即可達(dá)到對(duì)全部79個(gè)外顯子的測(cè)序。通過本研究，可為目前臨床得不到常規(guī)基因診斷的點(diǎn)突變患者及攜帶者提供確診方法、進(jìn)行產(chǎn)前診斷，最終可達(dá)到把DMD的基因診斷率從現(xiàn)時(shí)的70％至少提高到90％以上，將大大減少DMD患兒的出生。
　　 本研究還摸索用高分辨

25、溶解曲線(HRM)方法對(duì)DMD點(diǎn)突變進(jìn)行篩查，試圖尋找一種可以用于點(diǎn)突變初篩的方法，以圖降低實(shí)驗(yàn)成本。
　　 在本研究的另一部分，我們對(duì)DMD單個(gè)外顯子缺失情況進(jìn)行了深入的研究，用基因測(cè)序結(jié)合PCR方法對(duì)MLPA判讀為單個(gè)外顯子缺失的DMD患者進(jìn)行驗(yàn)證，鑒別單外顯子是真正缺失還是點(diǎn)突變，避免由此引出的誤診，從而達(dá)到準(zhǔn)確診斷的目的，并為基因修復(fù)治療提供理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 資料來源:病例主要來源本院，先證

26、者具有典型的臨床表現(xiàn)，經(jīng)血清肌酶、肌電圖或肌活檢證實(shí)，并排除其它類型的神經(jīng)肌肉系統(tǒng)遺傳病，經(jīng)MLPA證實(shí)不存在DMD基因外顯子的缺失和重復(fù)。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:
　　 1、采用Qiagen方法提取DMD患者外周血樣本基因組DNA;
　　 2、用MLPA方法排除先證者存在DMD基因外顯子的缺失和重復(fù);
　　 3、用改良的96孔板全外顯子測(cè)序方法對(duì)DMD基因全部79個(gè)外顯子進(jìn)行測(cè)序:經(jīng)PCR、PCR產(chǎn)物純化、測(cè)

27、序反應(yīng)、測(cè)序PCR產(chǎn)物純化、ABI3100遺傳分析儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳、用GeneMapper ID v3.1軟件和Mutation Surveyor軟件進(jìn)行結(jié)果分析等步驟獲得測(cè)序結(jié)果。
　　 4、采用LightScanner HRM32分析儀進(jìn)行HRM檢測(cè)，對(duì)某些未知點(diǎn)突變和已知點(diǎn)突變樣本進(jìn)行檢測(cè)。
　　 5、對(duì)MLPA法判斷為單個(gè)外顯子缺失的患者進(jìn)行PCR及測(cè)序驗(yàn)證。
　　 結(jié)果：
　　 1、用改良的96

28、孔板全外顯子測(cè)序方法對(duì)DMD基因全部79個(gè)外顯子進(jìn)行分析:選擇臨床診斷為DMD患者，并且排除其他神經(jīng)肌肉疾病、且經(jīng)MLPA排除DMD缺失突變與重復(fù)突變的16例樣本進(jìn)行了測(cè)序，本研究發(fā)現(xiàn)的點(diǎn)突變有:單堿基置換13例、單堿基缺失2例、2個(gè)堿基缺失1例，5個(gè)堿基插入1例，該例堿基的插入和三例堿基缺失導(dǎo)致了DMD的移碼突變。
　　 2、應(yīng)用測(cè)序結(jié)合PCR方法對(duì)MLPA診斷為單個(gè)外顯子缺失的DMD患者進(jìn)行驗(yàn)證，以鑒別真缺失還是點(diǎn)突變:37

29、例MLPA法判斷為單外顯子缺失的樣本中30例確實(shí)為DMD基因外顯子的缺失，占單個(gè)外顯子缺失中的81.08％;而另外7例經(jīng)PCR法驗(yàn)證未發(fā)現(xiàn)缺失，經(jīng)測(cè)序確證為存在外顯子的點(diǎn)突變，占單個(gè)外顯子缺失中的18.92％。
　　 3、HRM篩查DMD點(diǎn)突變方法的摸索
　　 (1)引物最佳退火溫度的優(yōu)化:設(shè)置Tm58℃/59℃/60℃/61℃/62℃/63℃/64℃/65℃，選擇61℃為最佳退火溫度。
　　 (2)DMD患者H

30、RM結(jié)果:對(duì)10例DMD點(diǎn)突變的樣本進(jìn)行了HRM分析，其中7例可以出現(xiàn)突變曲線，其余3例未能出現(xiàn)預(yù)期的結(jié)果。
　　 4、對(duì)一例攜帶有DMD外顯子54: c.7874A＞G（家系156C）的點(diǎn)突變攜帶者孕婦進(jìn)行了羊水產(chǎn)前診斷，胎兒為男性，結(jié)果為正常。
　　 結(jié)論：
　　 1、改良的96孔板全外顯子測(cè)序方法可通過一塊96孔板在一次實(shí)驗(yàn)中完成對(duì)79個(gè)外顯子的全測(cè)序，是對(duì)點(diǎn)突變型DMD基因突變的高效可靠的檢測(cè)方法。測(cè)序技

31、術(shù)可用于DMD點(diǎn)突變攜帶者產(chǎn)前診斷。
　　 2、高分辨溶解曲線(HRM)能快速地對(duì)一些稀有突變基因型進(jìn)行初篩檢測(cè)，但本研究不能分辨出300bp長(zhǎng)度以上的擴(kuò)增子中一個(gè)堿基的變化，對(duì)于擴(kuò)增子為300bp以上的外顯子需重新進(jìn)行引物設(shè)計(jì)、PCR條件優(yōu)化。
　　 3、經(jīng)MLPA檢測(cè)DMD基因?yàn)閱蝹€(gè)外顯子缺失時(shí)，應(yīng)聯(lián)合應(yīng)用PCR和基因測(cè)序技術(shù)進(jìn)行鑒別，以區(qū)分真缺失還是點(diǎn)突變，提高診斷的準(zhǔn)確率。
　　 第三章、女性DMD發(fā)病機(jī)

32、制研究及羊水iPS細(xì)胞系建立研究
　　 目的：DMD/BMD為X染色體隱性遺傳病，理論上發(fā)病者為男性，所以女性發(fā)病者多被誤診為與其癥狀相似的常染色體隱性遺傳的肢帶型肌營(yíng)養(yǎng)不良，近年來研究顯示女性患者的發(fā)病機(jī)制可能涉及X染色體失活等表觀遺傳調(diào)控，因此，研究女性發(fā)病者的分子機(jī)理具有較為重要的臨床價(jià)值和科學(xué)意義。本研究利用測(cè)序、染色體核型分析等方法、并采用Affymetrix CytoScan HD高分辨率基因芯片對(duì)女性DMD患者進(jìn)行

33、全基因組檢測(cè)，分析其是否微小缺失/重復(fù)，采用甲基化特異的PCR檢測(cè)X染色體失活狀態(tài)，研究其與女性DMD發(fā)病的相關(guān)性。
　　 DMD至今無特異性治療，只能對(duì)癥治療和支持治療。尋找有效的方法治療DMD一直是神經(jīng)病學(xué)界研究的熱點(diǎn)話題。誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(iPS)以其較好的免疫相容性被認(rèn)為是可以作為治療各種疾病的潛在來源，也是疾病機(jī)理研究的理想模型。羊水中細(xì)胞成分眾多，目前認(rèn)為羊水細(xì)胞是來源于胎兒和羊膜的異質(zhì)細(xì)胞群體，由不同來源的多種細(xì)胞

34、組成。羊水細(xì)胞具有良好多能性，可被誘導(dǎo)分化為各個(gè)胚層的細(xì)胞類型，本研究擬利用OCT4、KLF4兩因子法誘導(dǎo)羊水細(xì)胞重編程，獲得iPSCs，為DMD的干細(xì)胞治療和疾病模型建立提供良好的研究基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 資料來源:
　　 1、選擇在廣州醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院就診的4名女性DMD患者;
　　 2、羊水細(xì)胞:收集我院產(chǎn)前診斷中心具有羊水穿刺指證的1名孕婦20孕周，產(chǎn)前診斷檢測(cè)后廢棄的羊水細(xì)胞，經(jīng)捐贈(zèng)夫婦

35、知情同意及倫理委員會(huì)同意用于本實(shí)驗(yàn)。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:
　　 1、用Qiagen方法提取女性DMD患者外周血樣本基因組DNA，按照Affymtrix公司CytoScan HD芯片操作規(guī)程進(jìn)行操作及質(zhì)檢;
　　 2、X染色體失活狀態(tài)檢測(cè):基因組DNA經(jīng)過硫酸鹽處理后采用甲基化特異的引物進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳分析。
　　 3、iPS細(xì)胞制備:經(jīng)羊水細(xì)胞收集傳代、羊水細(xì)胞感染、hAFDC-iPSCs原代培

36、養(yǎng)、hAFDC-iPSCs傳代、RT-PCR檢測(cè)多能性基因、堿性磷酸酶(AP)檢測(cè)、免疫熒光染色、體外分化能力檢測(cè)、體內(nèi)分化潛能的檢測(cè)及染色體核型分析等主要步驟，制備iPS細(xì)胞。
　　 結(jié)果：
　　 1、DMD基因雙突變是女性患者發(fā)病機(jī)理之一:對(duì)一例女性DMD患者測(cè)序發(fā)現(xiàn)存在著DMD外顯子10: c.1034A＞G和DMD外顯子21: c.2645G＞A兩處單堿基置換突變。估計(jì)這兩處突變發(fā)生在不同的X染色體上，為雜合重復(fù)

37、突變，導(dǎo)致女性發(fā)病。
　　 2、染色體核型異常導(dǎo)致女性DMD發(fā)生:對(duì)一例女性DMD患者進(jìn)行了染色體核型分析，其核型是:46X，iX(q10)，即她的兩條X染色體中的一條為X長(zhǎng)臂等臂染色體，這一條染色體的短臂是丟失的，位于短臂上的DMD基因也因此丟失，而另一條正常的X染色體上DMD外顯子46-47發(fā)生了缺失突變，導(dǎo)致了這例女孩的發(fā)病。
　　 3、高分辨率基因芯片分析女性患者DMD基因拷貝數(shù)分析:
　　 對(duì)一個(gè)女性D

38、MD患者及其父母進(jìn)行全基因組拷貝數(shù)分析，發(fā)現(xiàn)患者DMD基因2-37外顯子重復(fù)（即拷貝數(shù)增加），該結(jié)果與MLPA檢測(cè)結(jié)果一致?；颊吣赣HDMD基因第4內(nèi)含子也存在一個(gè)重復(fù)片段，長(zhǎng)度為10Kbp。經(jīng)SNP基因分型發(fā)現(xiàn)患者重復(fù)的等位基因來源于母親。
　　 對(duì)MLPA檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)異常的一例女性DMD患者進(jìn)行全基因組拷貝數(shù)分析，發(fā)現(xiàn)Xp21.1區(qū)存在31 Kbp的拷貝數(shù)增加，該片段覆蓋DMD基因第47外顯子部分區(qū)域。第9內(nèi)含子存在2kbp的拷

39、貝數(shù)增加。
　　 4、女性DMD患者X染色體傾斜失活狀態(tài)檢測(cè):對(duì)上述兩個(gè)女性DMD家系的先證者和母親進(jìn)行X染色體傾斜失活分析發(fā)現(xiàn)，一例先證者為隨機(jī)失活，母親為傾斜失活;另一例先證者為傾斜失活，母親為隨機(jī)失活。
　　 5、用包裝hOct4、hKlf4等因子的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染羊水細(xì)胞，感染后第6天，未分化hAFDC-iPSCs克隆AP檢測(cè)均呈強(qiáng)陽(yáng)性圖。將克隆樣生長(zhǎng)細(xì)胞挑到無飼養(yǎng)層培養(yǎng)基培養(yǎng)，可見細(xì)胞緊密排列，邊界明顯未分化。h

40、AFDC-iPSCs每傳10代進(jìn)行核型檢測(cè)，已傳至40代，在傳代過程中2株細(xì)胞均能維持正常核型46，XX。hAFDC-iPSCs與人胚胎干細(xì)胞系(FY-HES-1)表達(dá)含量基本相一致，Oct4、NANOG基因呈高表達(dá)，羊水細(xì)胞不表達(dá)。hAFDC-iPSCs克隆表面抗原TRA-1-60呈現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性;NANOG/OCT4表達(dá)陽(yáng)性，顯示未分化狀態(tài)。
　　 結(jié)論：
　　 1、DMD基因雙突變是導(dǎo)致女性DMD患者發(fā)病的原因之一;

41、r>　　 2、DMD基因突變合并染色體核型異常如X等臂染色體等可導(dǎo)致女性DMD發(fā)生;
　　 3、利用高密度基因芯片應(yīng)用于女性DMD患者發(fā)病機(jī)理的研究發(fā)現(xiàn)DMD基因存在拷貝數(shù)變異，部分變異可能涉及外顯子。一個(gè)女性含有外顯子2-37重復(fù)突變，患者的母親DMD基因內(nèi)含子存在小片段重復(fù)，而患者發(fā)生2-37重復(fù)的等位基因來源于母親。
　　 4、利用OCT4、KLF4兩因子法誘導(dǎo)羊水細(xì)胞重編程，獲得iPSCs，為DMD的干細(xì)胞治療