人iPSCs誘導體系的優(yōu)化.pdf

1、誘導性多潛能干細胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)是干細胞領域的重大發(fā)現(xiàn)，它具有胚胎干細胞(embryonic stem cells, ESCs)的特性并且完全避免了ESCs研究應用所面臨的倫理及技術上的雙重困境。本實驗體外培養(yǎng)了人胎兒成纖維細胞(human fetus fibroblast cells, hFFCs)，對其培養(yǎng)體系進行了優(yōu)化；對逆轉錄病毒載體pEYK·E4進行了鑒定，優(yōu)化了

2、其轉染條件以包裝出高滴度的逆轉錄病毒顆粒；體外培養(yǎng)了小鼠胚胎成纖維細胞(mouse embryonal fibroblasts, MEFs)并摸索由其制備飼養(yǎng)層的最佳條件；使用逆轉錄病毒感染 hFFCs后觀察其因目的基因的作用而發(fā)生的變化。本實驗對人iPSCs的誘導體系進行了整體性的優(yōu)化，具體研究內(nèi)容及結果如下：
　　使用單細胞培養(yǎng)法和組織塊培養(yǎng)法原代培養(yǎng)了 hFFCs，并對其體外培養(yǎng)體系(培養(yǎng)基類型、胎牛血清濃度、堿性成纖細細胞

3、生長因子)進行了優(yōu)化。結果表明，由組織塊培法原代培養(yǎng)的細胞形態(tài)更好，傳代后極少出現(xiàn)未貼壁的死細胞；DMEM(高糖)培養(yǎng)基、8％ FBS、10 ng/mL bFGF為hFFCs培養(yǎng)的最佳條件，此條件下培養(yǎng)由組織塊培養(yǎng)法原代獲取的hFFCs細胞形態(tài)良好、增殖能力強，群體倍增時間短(19.3 h左右)，冷凍后仍能保持很好生物學特性，適合作為目的細胞以誘導成為iPSCs。
　　采用限制酶酶切、PCR、測序等方法對重組逆轉錄病毒載體 pEY

4、K·E4進行鑒定。結果表明，pEYK·E4基于逆轉錄病毒載體 pEYK3.1構建，包含 c-myc、Klf4、Sox2、Oct4四個轉錄因子，大小為8228 bp。隨后采用脂質(zhì)體介導和磷酸鈣介導的方法于293T細胞中對 pEYK·E4進行病毒包裝并測定滴度，并以影響磷酸鈣介導轉染質(zhì)粒的三個因素(293T細胞的接種密度、質(zhì)粒DNA的量、細胞培養(yǎng)環(huán)境CO2濃度)設計正交試驗摸索最優(yōu)轉染條件。結果表明，磷酸鈣介導的質(zhì)粒DNA轉染時，最佳條件為

5、293T細胞的接種密度為5×105個/mL、細胞培養(yǎng)環(huán)境CO2濃度為3%、質(zhì)粒DNA的量為30μg，獲得的病毒滴度為1.9×104 CFU/mL；脂質(zhì)體法所獲得的病毒滴度為4×104 CFU/mL。
　　使用單細胞培養(yǎng)法和組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)MEFs，對絲裂霉素C處理MEFs制備飼養(yǎng)層細胞的濃度和處理時間進行摸索。結果表明，制備飼養(yǎng)層時最佳條件為10μg/mL的絲裂霉素C處理MEFs2 h。
　　將逆轉錄病毒顆粒感染兩次的hFF