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文檔簡介
1、iPS技術(shù)為構(gòu)建疾病模型、研制評估新藥、基因治療及再生醫(yī)學(xué)等研究奠定了基礎(chǔ),是干細(xì)胞研究領(lǐng)域的里程碑。豬在生理及體型上與人相似,因此研究豬的iPS細(xì)胞意義重大。但目前豬成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)為iPS的重編程效率不足1%。研究發(fā)現(xiàn),組蛋白H3K9甲基化阻礙體細(xì)胞重編程,降低H3K9甲基化水平可促進(jìn)iPS誘導(dǎo)。組蛋白甲基化水平受組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶與組蛋白去甲基化酶共同調(diào)節(jié)。JHDM2A,即JmjC結(jié)構(gòu)域組蛋白去甲基化酶2,可使H3K9me1/2發(fā)生去
2、甲基化。過表達(dá)JHDM2A基因可促進(jìn)與ESCs融合的小鼠NSCs重編程為iPS,促進(jìn)iPSCs誘導(dǎo);還可調(diào)節(jié)胚胎干細(xì)胞的自我更新。本研究首先采用DOX誘導(dǎo)型的慢病毒載體體系,誘導(dǎo)獲得豬多能干細(xì)胞(piPSCs),在此基礎(chǔ)上通過過表達(dá)JHDM2A基因,探究組蛋白H3K9me1/2甲基化水平對豬iPSCs誘導(dǎo)效率的影響,并對其分子機(jī)制進(jìn)行初步探究,以便為進(jìn)一步提高iPSCs誘導(dǎo)效率、建立大家畜ESCs系奠定基礎(chǔ)。本研究主要結(jié)果如下:
3、 1、豬JHDM2A基因克隆及其表達(dá)載體構(gòu)建
根據(jù)NCBI上公布的豬JHDM2A基因序列,設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物,克隆得到豬JHDM2A基因,其編碼區(qū)長度為3945 bp,編碼1315個氨基酸。多重氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn),豬JHDM2A基因與黃牛、水牛、綿羊和人相應(yīng)氨基酸序列的同源性分別為93.5%、94.7%、94.7%、93.8%。蛋白質(zhì)分子系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果表明,JHDM2A基因在物種進(jìn)化過程中高度保守。免疫組化結(jié)果顯示,JH
4、DM2A蛋白在不同發(fā)育階段豬卵泡中均有表達(dá)。進(jìn)一步構(gòu)建并驗(yàn)證了pLVX-IRES-ZsGreen1-JHDM2A真核表達(dá)載體。
2、過表達(dá)JHDM2A基因?qū)ωiiPSCs形成及相關(guān)基因表達(dá)的影響
首先利用DOX誘導(dǎo)型慢病毒載體體系,將OSKM因子組合導(dǎo)入豬成纖維細(xì)胞,將其誘導(dǎo)為iPSCs,在此基礎(chǔ)上過表達(dá)JHDM2A基因,并分別對獲得的iPSCs進(jìn)行鑒定。
當(dāng)過表達(dá)JHDM2A基因時,細(xì)胞在第3d出現(xiàn)形變,第
5、8d形成piPSCs克隆,分別比未處理組提前了1d、2d。AP檢測陽性克隆數(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn),與未處理組相比,過表達(dá)JHDM2A基因?qū)嶒?yàn)組的誘導(dǎo)效率提高了8倍,且iPSCs克隆大小更均勻、邊緣更整齊、細(xì)胞更致密,AP染色著色更深。RT-PCR分析結(jié)果顯示,所檢測的三種細(xì)胞均表達(dá)Klf4、c-Myc、Nanog多能性基因,弱表達(dá)Sox2基因;過表達(dá)JHDM2A實(shí)驗(yàn)組和未處理組的piPSCs均表達(dá)Oct4,而PFF弱表達(dá)表達(dá)Oct4。定量PCR結(jié)果
6、顯示,與未處理組相比,過表達(dá)JHDM2A實(shí)驗(yàn)組piPSCs多能性基因Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog表達(dá)顯著升高(P<0.05),其中對Oct4的表達(dá)影響極顯著(P<0.01)。去DOX后,過表達(dá)JHDM2A實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中的外源基因沉默,內(nèi)源性O(shè)ct4基因表達(dá)逐代幾乎沒有變化,Sox2、Nanog基因表達(dá)逐代降低,Klf4、c-Myc基因表達(dá)先升高后降低。與未處理組和PFF相比,過表達(dá)JHDM2A實(shí)驗(yàn)組piPSC組蛋白
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