廣西巴馬小型豬類Na_ve狀態(tài)iPSCs的初步研究.pdf

1、本研究以廣西巴馬小型豬的成纖維細(xì)胞(Porcine Fetal Fibroblasts，PFF)、骨髓間充質(zhì)細(xì)胞(Porcine Bone marrow Menenchymal Stem Cells，PBMSCs)和脂肪干細(xì)胞(Porcine Adipose-derived Stem Cells，PASCs)為材料，通過(guò)四環(huán)素(Doxycycline，DOX)誘導(dǎo)型慢病毒載體將Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4、Lin28、Nan

2、og導(dǎo)入不同種類細(xì)胞中，比較不同種類細(xì)胞和不同培養(yǎng)基條件下的重編程效率，并對(duì)獲得的類克隆進(jìn)行生物學(xué)鑒定。同時(shí)，在培養(yǎng)基中添加p38和JNK通路抑制劑SB203580和SP600125，以期獲得原始態(tài)(Na(i)ve)的豬誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(porcine induced PluripotentStem Cells，piPSCs)。研究結(jié)果總結(jié)如下。
　　1、廣西巴馬小型豬不同種類細(xì)胞和不同培養(yǎng)條件下重編程效率的比較。不同種類細(xì)胞經(jīng)過(guò)病

3、毒感染后，在人胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞完全培養(yǎng)液即mTeSR培養(yǎng)條件下于感染后的D10-D12形成克隆，通過(guò)克隆形態(tài)觀測(cè)和堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，AP)染色計(jì)數(shù)，PBMSCs、PASCs、PFF的重編程效率分別為0.28％、0.25％、0.23％，PBMSCs顯著高于PFF，PASCs與PBMSCs、PFF之間無(wú)顯著性差異，但在mTeSR培養(yǎng)條件下未獲得穩(wěn)定傳代的細(xì)胞株。
　　為改進(jìn)培養(yǎng)條件，比較了

4、PBMSCs在含bFGF、2i(PD0325901+CHIR99021)+Lif和2i+Lif+bFGF培養(yǎng)基的克隆形成效率，發(fā)現(xiàn)PBMSCs在bFGF、2i+Lif、2i+Lif+bFGF的重編程效率分別為1.12％、0.84％、1.07％，bFGF、2i+Lif+bFGF顯著高于2i+Lif組，bFGF和2i+Lif+bFGF組間差異不顯著。為了確認(rèn)最佳傳代培養(yǎng)條件，分別挑取不同培養(yǎng)條件來(lái)源的PBMSCs-piPSCs克隆，使用相應(yīng)

5、培養(yǎng)基繼續(xù)傳代培養(yǎng)，并進(jìn)一步檢測(cè)其內(nèi)源性基因的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，bFGF組克隆的內(nèi)源基因Oct4、Klf4的表達(dá)量最低，從P10開始逐漸凋亡分化;2i+Lif組的克隆突起感較強(qiáng)，但生長(zhǎng)緩慢，從P6開始逐漸停止增殖;2i+Lif+bFGF組的克隆內(nèi)源基因Oct4、Klf4的表達(dá)量最高，傳至P15克隆形態(tài)仍未發(fā)生改變，增殖較快。綜合重編程效率、克隆傳代次數(shù)及內(nèi)源性基因的表達(dá)情況，2i+Lif+bFGF的培養(yǎng)條件對(duì)piPSCs克隆的獲得和傳

6、代培養(yǎng)具有較好的效果。
　　2、來(lái)自不同種類細(xì)胞的piPSCs的生物學(xué)特性鑒定。使用含2i+Lif+bFGF的培養(yǎng)條件獲得來(lái)源于PBMSCs、PASCs、PFF的iPSCs克隆，然后對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)特性鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，克隆呈堿性磷酸酶陽(yáng)性;表達(dá)內(nèi)源多能性相關(guān)基因Oct4、Sox2及E-cadherin、Dnmt3b、GDF3，同時(shí)表達(dá)Primed和Na(i)ve狀態(tài)多能干細(xì)胞的候選標(biāo)志基因FGF5和Klf4、Klf5。去掉培養(yǎng)基中的

7、DOX后，外源基因逐漸沉默，2i+Lif+bFGF的培養(yǎng)條件仍能持續(xù)傳代培養(yǎng)piPSCs，piPSCs的增殖速率要高于對(duì)應(yīng)的體細(xì)胞，PBMSCs、PASCs、PFF來(lái)源iPSCs的群體倍增時(shí)間分別為0.95d、0.93d、0.97d。核型分析結(jié)果顯示:piPSCs核型正常率在70％以上，具有38條染色體;體外分化實(shí)驗(yàn)表明，piPSCs可形成擬胚體(Embryiod body，EB)，并表達(dá)內(nèi)、中、外三胚層的標(biāo)記性基因，具有體外分化潛能。

8、以上結(jié)果表明，不同種類細(xì)胞來(lái)源的piPSCs具有Primed和Na(i)ve狀態(tài)多能干細(xì)胞的特征。
　　3、SB203580和SP600125促進(jìn)piPSCs向Na(i)ve狀態(tài)轉(zhuǎn)變的初步研究。在2i+Lif+bFGF的基礎(chǔ)上添加p38和JNK通路抑制劑SB203580和SP600125，以期獲得接近于Na(i)ve狀態(tài)的piPSCs。采用cck-8試劑盒檢測(cè)不同濃度SB203580、SP600125對(duì)PBMSCs增殖的影響，最終

9、采用5μM濃度的SB203580和SP600125用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。SB203580和SP600125（簡(jiǎn)稱2s）聯(lián)合2i+Lif+bFGF的培養(yǎng)條件，成功獲得來(lái)源于PBMSCs的2s-piPSCs克隆。對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)特性檢測(cè)表明，2s-piPSCs克隆呈堿性磷酸酶陽(yáng)性;表達(dá)Na(i)ve狀態(tài)多能干細(xì)胞的候選多能性相關(guān)基因Oct4、Sox2、Klf4、Klf5、Rex1和SSEA1等，不表達(dá)Primed狀態(tài)多能干細(xì)胞的候選基因FGF5;QR

10、T-PCR結(jié)果表明該培養(yǎng)體系下的Klf4表達(dá)水平顯著高于2i+Lif+bFGF和bFGF組的克隆;此外，2s-piPSCs可以使用胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代，類似于小鼠胚胎干細(xì)胞的傳代培養(yǎng)，可形成單克隆。以上結(jié)果表明，p38和JNK通路抑制劑SB203580和SP600125可以促進(jìn)piPSCs向Na(i)ve狀態(tài)轉(zhuǎn)變，獲得的2s-piPSCs克隆具有部分Na(i)ve狀態(tài)多能干細(xì)胞的生物學(xué)特性。
　　以上結(jié)果表明，PBMSCs重編程為