2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、目的:
  1.建立人iPSCs誘導(dǎo)類肝細(xì)胞模型。
  2.初步評價(jià)人iPSCs誘導(dǎo)類肝細(xì)胞在中藥肝毒性檢測中的應(yīng)用。
  方法:
  1.人iPSCs誘導(dǎo)類肝細(xì)胞的細(xì)胞因子4階段誘導(dǎo)分化方法:第1階段,內(nèi)胚層細(xì)胞的誘導(dǎo),即在人iPSCs中加入100 ng/mL激活素A(Activin A)、10 ng/mL骨形態(tài)發(fā)生蛋白-4(BMP-4)、20 ng/mL成纖維生長因子-2(FGF-2)、2% B27和1640

2、細(xì)胞培養(yǎng)液,每天換誘導(dǎo)培養(yǎng)液,一共8天;第2階段,內(nèi)胚層細(xì)胞向類肝細(xì)胞的分化,即加入20 ng/mL BMP-4、10 ng/mL FGF-2、2% B27和1640細(xì)胞培養(yǎng)液,每天換誘導(dǎo)培養(yǎng)液,一共5天;第3階段,類肝細(xì)胞的擴(kuò)增,即加入20 ng/mL肝細(xì)胞生長因子(HGF)、2% B27和1640細(xì)胞培養(yǎng)液,每天換誘導(dǎo)培養(yǎng)液,一共5天;第4階段,類肝細(xì)胞的成熟,加入HCM和20 ng/mL制瘤素M(Oncostat in M),每天

3、換誘導(dǎo)培養(yǎng)液,一共5天。用倒置熒光顯微鏡拍攝人iPSCs的誘導(dǎo)過程中細(xì)胞形態(tài)動態(tài)變化,觀察人iPSCs誘導(dǎo)類肝細(xì)胞是否具有肝細(xì)胞的形態(tài)。
  2.免疫細(xì)胞化學(xué)染色(immunofluorescence staining):用4%濃度的多聚甲醛固定細(xì)胞,然后用0.5% Triton在細(xì)胞表面穿孔,用山羊血清封閉1個小時,加入1%BSA稀釋的一抗,37℃雜交2個小時,避光放置在4℃過夜,加入的1%BSA稀釋的二抗,放置在37℃,雜交1

4、個小時。加入5μg/mL的DAPI染核,拿到熒光顯微鏡下拍照并保存圖片。觀察人iPSCs誘導(dǎo)類肝細(xì)胞過程中的特異性蛋白:倒置熒光顯微鏡觀察誘導(dǎo)過程中的第8天后限定性內(nèi)胚層特異性蛋白叉頭框轉(zhuǎn)錄因子A2(FOXA2)和性別決定區(qū)Y框蛋白17(SOX17)的表達(dá)情況,看其是否表達(dá)來確定內(nèi)胚層細(xì)胞是否誘導(dǎo)成功;第18天后肝細(xì)胞特異性蛋白甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(ALB)的表達(dá)情況,看其是否表達(dá)來確定類肝細(xì)胞是否形成;第23天后成熟肝細(xì)胞功能蛋

5、白α1-抗胰蛋白酶(AAT)、肝細(xì)胞色素P4503A4(CYP3A4)的表達(dá)情況,看其是否表達(dá)來確定誘導(dǎo)后的類肝細(xì)胞是否具有人成熟肝細(xì)胞的主要功能特異性蛋白。
  3.實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR):提取總RNA,然后按照試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR,使用7500 PCR儀檢測。檢測誘導(dǎo)第23天后肝細(xì)胞特異性基因細(xì)胞角蛋白8(CK8)、細(xì)胞角蛋白18(CK18)、細(xì)胞角蛋白19(CK19)、AFP、ALB的表達(dá),觀察誘導(dǎo)

6、后的類肝細(xì)胞的人肝細(xì)胞是否表達(dá)人成熟肝細(xì)胞的主要基因。
  4.吲哚青綠(ICG)攝取實(shí)驗(yàn):第23天將ICG加入到類肝細(xì)胞中,37℃孵育1h,光學(xué)顯微鏡下觀察ICG是否被誘導(dǎo)后的類肝細(xì)胞攝取以確定誘導(dǎo)后的類肝細(xì)胞是否具有肝細(xì)胞的特異性功能。
  5.雷公藤凍干粉對人iPSCs誘導(dǎo)類肝細(xì)胞的肝功能的影響:誘導(dǎo)完成后,在成功誘導(dǎo)好的類肝細(xì)胞中加入雷公藤凍干粉0 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL、4 mg/mL、8 mg

7、/mL,在37℃,5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,取細(xì)胞培養(yǎng)上清按照試劑盒操作方法,用酶標(biāo)儀在570 nm檢測OD值并計(jì)算谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)的活性,取細(xì)胞按照試劑盒操作方法,用酶標(biāo)儀在532 nm檢測OD值并計(jì)算丙二醛(MDA)的濃度,在410 nm檢測OD值并計(jì)算谷胱甘肽(GSH)的濃度和在450 nm檢測OD值并計(jì)算超氧化物歧化酶(SOD)的活性,初步評價(jià)雷公藤凍干粉對人iPSCs誘導(dǎo)類肝細(xì)胞的肝毒性作用

8、。
  6.雷公藤凍干粉對LO2細(xì)胞的肝功能的影響:誘導(dǎo)完成后,在LO2細(xì)胞中加入雷公藤凍干粉0 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL、4 mg/mL、8 mg/mL,在37℃,5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,取細(xì)胞培養(yǎng)上清按照試劑盒操作方法,用酶標(biāo)儀在570 nm檢測OD值并計(jì)算ALT、AST的活性,取細(xì)胞按照試劑盒操作方法,用酶標(biāo)儀在532 nm檢測OD值并計(jì)算MDA的濃度,在410 nm檢測OD值并計(jì)算GSH的濃

9、度和在450 nm檢測OD值并計(jì)算SOD的活性,初步評價(jià)雷公藤凍干粉對LO2細(xì)胞的肝毒性作用。
  7.雷公藤甲素對人iPSCs類肝細(xì)胞的肝功能的影響:誘導(dǎo)完成后,在成功誘導(dǎo)好的類肝細(xì)胞中加入雷公藤甲素0 mg/mL、2 mg/mL、6 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL,在37℃,5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,取細(xì)胞培養(yǎng)上清按照試劑盒操作方法,用酶標(biāo)儀在570 nm檢測OD值并計(jì)算ALT、AST的活性,取細(xì)胞

10、按照試劑盒操作方法,用酶標(biāo)儀在532 nm檢測OD值并計(jì)算MDA的濃度,在410 nm檢測OD值并計(jì)算GSH的濃度和在450 nm檢測OD值并計(jì)算SOD的活性,初步評價(jià)雷公藤甲素對人iPSCs誘導(dǎo)類肝細(xì)胞的肝毒性作用。
  8.雷公藤甲素對LO2細(xì)胞的肝功能的影響:誘導(dǎo)完成后,在LO2細(xì)胞中加入雷公藤甲素0 mg/mL、2 mg/mL、6 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL,在37℃,5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24

11、h,取細(xì)胞培養(yǎng)上清按照試劑盒操作方法,用酶標(biāo)儀在570 nm檢測OD值并計(jì)算ALT、AST的活性,取細(xì)胞按照試劑盒操作方法,用酶標(biāo)儀在532 nm檢測OD值并計(jì)算MDA的濃度,在410 nm檢測OD值并計(jì)算GSH的濃度和在450 nm檢測OD值并計(jì)算SOD的活性,初步評價(jià)雷公藤甲素對LO2細(xì)胞的肝毒性作用。
  9.雷公藤凍干粉對人iPSCs誘導(dǎo)類肝細(xì)胞和LO2細(xì)胞的肝功能的影響比較對比雷公藤凍干粉對人iPSCs誘導(dǎo)類肝細(xì)胞與雷公

12、藤凍干粉對LO2細(xì)胞的肝毒性作用,初步評價(jià)人iPSCs誘導(dǎo)的類肝細(xì)胞在中藥肝毒性檢測中的應(yīng)用。
  10.雷公藤甲素對人iPSCs誘導(dǎo)類肝細(xì)胞和LO2細(xì)胞的肝功能的影響比較對比雷公藤甲素對人iPSCs誘導(dǎo)類肝細(xì)胞與雷公藤甲素對LO2細(xì)胞的肝毒性作用,初步評價(jià)人iPSCs誘導(dǎo)類肝細(xì)胞在中藥肝毒性檢測中的應(yīng)用。
  結(jié)果:
  1.人iPSCs誘導(dǎo)類肝細(xì)胞分化過程中的細(xì)胞形態(tài)動態(tài)變化:倒置熒光顯微鏡光學(xué)圖片顯示,誘導(dǎo)的第0

13、d的人iPSCs呈克隆團(tuán)塊樣生長,每個克隆團(tuán)塊由多個單個細(xì)胞相互密集契合組成,單個細(xì)胞的大小、形狀不一致,邊緣棱角清晰;誘導(dǎo)的第3d,相對于第0d,克隆內(nèi)的細(xì)胞逐漸變大,形態(tài)逐漸變圓;誘導(dǎo)第12 d,可觀察到相對于第3d,克隆內(nèi)的細(xì)胞變大,形狀趨于一致,棱角逐漸不明顯;誘導(dǎo)第23 d,克隆內(nèi)的大部分細(xì)胞變成大小、形狀均一的多邊形細(xì)胞,細(xì)胞呈鋪路石樣整齊排列。說明人iPSCs誘導(dǎo)類肝細(xì)胞具有人肝細(xì)胞的形態(tài)。
  2.免疫細(xì)胞化學(xué)染色

14、結(jié)果:免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測結(jié)果顯示限定性內(nèi)胚層特異性蛋白FoxA2和Sox17在內(nèi)胚層細(xì)胞誘導(dǎo)階段有表達(dá),誘導(dǎo)率均為80%左右,說明內(nèi)胚層細(xì)胞誘導(dǎo)成功;肝細(xì)胞特異性蛋白AFP和ALB在人iPSCs向類肝細(xì)胞分化階段和類肝細(xì)胞增殖階段有表達(dá),誘導(dǎo)率均為90%左右,說明類肝細(xì)胞已經(jīng)形成;肝細(xì)胞功能性蛋白AAT和CYP3A4在類肝細(xì)胞成熟階段有表達(dá),誘導(dǎo)率分別為80%和90%左右,說明人iPSCs誘導(dǎo)類肝細(xì)胞具有人成熟肝細(xì)胞的主要功能特異性蛋

15、白。
  3.qPCR對人肝特異性基因的檢測結(jié)果:qPCR檢測結(jié)果顯示肝細(xì)胞特異性基因CK8、CK18、CK19、AFP、ALB在類肝細(xì)胞中有表達(dá),相對于誘導(dǎo)前的細(xì)胞,人iPSCs誘導(dǎo)類肝細(xì)胞基因表達(dá)率明顯升高。
  4.ICG攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果:ICG攝取實(shí)驗(yàn)顯示誘導(dǎo)后的類肝細(xì)胞被染成綠色,說明人iPSCs誘導(dǎo)類肝細(xì)胞具有人肝細(xì)胞的特異性功能。
  5.雷公藤凍干粉對人iPSCs源的肝細(xì)胞的肝功能的影響:與0 mg/mL的

16、對照組比較,雷公藤凍干粉的1,2,4,8 mg/mL各干預(yù)組細(xì)胞培養(yǎng)液上清中的ALT和AST含量顯著升高,呈劑量正相關(guān)性,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;細(xì)胞中MDA的濃度顯著升高,呈劑量正相關(guān)性,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;細(xì)胞中GSH的濃度和SOD的活性顯著降低,呈劑量負(fù)相關(guān)性,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
  6.雷公藤凍干粉對LO2細(xì)胞的肝功能的影響:與0 mg/mL的對照組比較,雷公藤凍干粉的1,2,4,8 mg/mL各干預(yù)組細(xì)胞培養(yǎng)液上清中的AL

17、T和AST含量顯著升高,呈劑量正相關(guān)性,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;細(xì)胞中MDA的濃度顯著升高,呈劑量正相關(guān)性,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;細(xì)胞中GSH的濃度和SOD的活性顯著降低,呈劑量負(fù)相關(guān)性,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
  7.雷公藤甲素對人iPSCs源的肝細(xì)胞的肝功能的影響:與0 mg/mL的對照組比較,雷公藤甲素的2,6,10,20 mg/mL各干預(yù)組細(xì)胞培養(yǎng)液上清中的ALT和AST含量顯著升高,呈劑量正相關(guān)性,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;細(xì)胞中MD

18、A的濃度顯著升高,呈劑量正相關(guān)性,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;細(xì)胞中GSH的濃度和SOD的活性顯著降低,呈劑量負(fù)相關(guān)性,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
  8.雷公藤甲素對LO2細(xì)胞的肝功能的影響:與0 mg/mL的對照組比較,雷公藤凍干粉的1,2,4,8 mg/mL各干預(yù)組細(xì)胞培養(yǎng)液上清中的ALT和AST含量顯著升高,呈劑量正相關(guān)性,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;細(xì)胞中MDA的濃度顯著升高,呈劑量正相關(guān)性,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;細(xì)胞中GSH的濃度和SOD的活

19、性顯著降低,呈劑量負(fù)相關(guān)性,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
  9.雷公藤凍干粉對人iPSCs誘導(dǎo)類肝細(xì)胞和LO2細(xì)胞的肝功能的影響比較:人iPSCs誘導(dǎo)類肝細(xì)胞上清中的ALT和AST含量隨著雷公藤凍干粉濃度的增高而升高,呈劑量正相關(guān)性,LO2細(xì)胞上清中的ALT和AST含量隨著雷公藤凍干粉濃度的增高而升高,呈劑量正相關(guān)性,雷公藤凍干粉對人iPSCs誘導(dǎo)類肝細(xì)胞膜毒性與雷公藤凍干粉對LO2細(xì)胞的肝細(xì)胞膜毒性的作用趨勢一致;人iPSCs誘導(dǎo)類肝

20、細(xì)胞中MDA濃度隨著雷公藤凍干粉濃度的增高而升高,呈劑量正相關(guān)性,LO2細(xì)胞上清中MDA濃度隨著雷公藤凍干粉濃度的增高而升高,呈劑量正相關(guān)性,雷公藤凍干粉對人iPSCs誘導(dǎo)類肝細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化毒性與雷公藤凍干粉對LO2細(xì)胞的肝細(xì)胞膜膜脂質(zhì)過氧化毒性的作用趨勢一致;人iPSCs誘導(dǎo)類肝細(xì)胞上清中的GSH的濃度和SOD活性隨著雷公藤凍干粉濃度的增高而升高,呈劑量負(fù)相關(guān)性,LO2細(xì)胞上清中的GSH的濃度和SOD活性隨著雷公藤凍干粉濃度的增高而

21、升高,呈劑量負(fù)相關(guān)性,雷公藤凍干粉對人iPSCs誘導(dǎo)類肝細(xì)胞內(nèi)氧自由基清除酶毒性與雷公藤凍干粉對LO2細(xì)胞的肝細(xì)胞內(nèi)氧自由基清除酶毒性的作用趨勢一致。
  10.雷公藤甲素對人iPSCs誘導(dǎo)類肝細(xì)胞和LO2細(xì)胞的肝功能的影響比較:人iPSCs誘導(dǎo)類肝細(xì)胞上清中的ALT和AST含量隨著雷公藤甲素濃度的增高而升高,呈劑量正相關(guān)性,LO2細(xì)胞上清中的ALT和AST含量隨著雷公藤甲素濃度的增高而升高,呈劑量正相關(guān)性,雷公藤甲素對人iPSC

22、s誘導(dǎo)類肝細(xì)胞膜毒性與雷公藤甲素對LO2細(xì)胞的肝細(xì)胞膜毒性的作用趨勢一致;人iPSCs誘導(dǎo)類肝細(xì)胞中MDA濃度隨著雷公藤甲素濃度的增高而升高,呈劑量正相關(guān)性,LO2細(xì)胞上清中MDA濃度隨著雷公藤甲素濃度的增高而升高,呈劑量正相關(guān)性,雷公藤甲素對人iPSCs誘導(dǎo)類肝細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化毒性與雷公藤甲素對LO2細(xì)胞的肝細(xì)胞膜膜脂質(zhì)過氧化毒性的作用趨勢一致;人iPSCs誘導(dǎo)類肝細(xì)胞上清中的GSH的濃度和SOD活性隨著雷公藤甲素濃度的增高而升高,呈

23、劑量負(fù)相關(guān)性,LO2細(xì)胞上清中的GSH的濃度和SOD活性隨著雷公藤甲素濃度的增高而升高,呈劑量負(fù)相關(guān)性,雷公藤甲素對人iPSCs誘導(dǎo)類肝細(xì)胞內(nèi)氧自由基清除酶毒性與雷公藤凍干粉對LO2細(xì)胞的肝細(xì)胞內(nèi)氧自由基清除酶毒性的作用趨勢一致。
  結(jié)論:
  1.人iPSCs細(xì)胞因子四步誘導(dǎo)分化方法可以將人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化成類肝細(xì)胞,分化成的類肝細(xì)胞具有肝細(xì)胞的形態(tài),肝細(xì)胞的特異性蛋白,基因,肝細(xì)胞的特異性功能。
  2.雷

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