表達豬瘟兔化疫苗株E0蛋白的PK15細胞系構(gòu)建和3′端非編碼區(qū)的研究.pdf

1、本試驗利用EGFP為轉(zhuǎn)移載體和標志蛋白，對E0蛋白在PK-15細胞內(nèi)的表達和定位做了初步研究，構(gòu)建了能穩(wěn)定表達E0蛋白的PK-15細胞系，為后續(xù)的HCLV的全長cDNA轉(zhuǎn)染PK-15細胞和豬瘟兔化弱毒的E0缺失突變株奠定了基礎(chǔ)；石門株經(jīng)兔體480代致弱后，在其基因組的3'UTR插入了一個12-nt(ttttttctttttt)的片斷，是豬瘟兔化弱毒苗區(qū)別于石門株的標志，因此本試驗選用PK-15細胞，將HCLV株在PK-15細胞上連續(xù)傳代

2、34代，以期了解每一代病毒的增殖情況和插入標志12-nt的變化，從而了解HCLV株在細胞上的增殖復制情況。從本試驗出發(fā)，建議在疫苗生產(chǎn)中，盡量減少傳代次數(shù)。 1.從豬瘟病毒兔化弱毒株兔體480代后，牛睪丸細胞第3代的細胞毒中提取總RNA，以該總RNA為模板，進行反轉(zhuǎn)錄，PCR擴增出了豬瘟病毒兔化弱毒株的囊膜糖蛋白E0基因，瓊脂糖凝膠電泳表明其大小與預計相符。將擴增出的E0基因克隆到pGEMT-easy載體中，用自動序列分析儀對其

3、進行序列測定。將測得的序列與從GenBank中選取三株強毒株、三株弱毒株序列進行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，我們測定的HCLV株的E0基因的核酸序列與Brescia的E0基因序列的同源性為94.6％，與Eystrup的E0基因序列的同源性為95.0％，與石門株的E0基因序列的同源性為95.7％，HCLV株與CAP的E0基因序列的同源性為95.4％，與GPE的E0基因序列的同源性為94.5％，與C株的E0基因序列的同源性為98.12％。根據(jù)HCLV株

4、的E0基因的核酸序列推導的氨基酸序列與Brescia的E0基因氨基酸序列的同源性為94.7％，與Eystrup的E0基因氨基酸序列的同源性為93.8％，與石門株的E0基因氨基酸序列的同源性為95.2％，HCLV株與CAP的E0基因氨基酸序列的同源性為93.8％，與GPE的E0基因氨基酸序列的同源性為93.0％，與C株的E0基因氨基酸序列的同源性為97.4％。將克隆到pGEMT-easy載體中的E0基因雙酶切回收后，連接到增強型綠色熒光蛋

5、白(EGFP)中，經(jīng)酶切、PCR、測序后證實，HCLV株的E0基因正確的插入到了EGFP中。 2.利用脂質(zhì)體分別將高純度提取的pEGFP-N1Vector和E0目的DNA的重組子利用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染PK-15、BHK-21、VERO三種細胞，直接在熒光顯微鏡下用藍光激發(fā)進行觀察，在三種細胞中都可以觀察到綠色熒光，而且在轉(zhuǎn)染后的24h，48h，72h三個時間點上，觀察到的熒光細胞數(shù)量逐漸增多，在72h時熒

6、光細胞的數(shù)量在三種細胞中都達到最多，總的來看，在PK-15中熒光細胞的數(shù)量最多。通過對細胞熒光的定位發(fā)現(xiàn)，重組質(zhì)粒的熒光主要分布在胞漿內(nèi)，而且細胞核周圍的熒光較強，胞核與胞漿的界限明顯，尤其是在PK-15細胞和VERO細胞中這種現(xiàn)象尤為明顯。未攜帶E0目的DNA的pEGFP-N1Vector轉(zhuǎn)染三種細胞后，都可以觀察到綠色熒光，但是整個細胞中是均勻出現(xiàn)熒光的。 3.經(jīng)酶切、PCR、單抗間接免疫熒光檢測，PK-E0細胞中有大量的H

7、CLV的E0的表達，單純的PK-15細胞中沒有E0的表達。 4.從繪制的豬瘟兔化弱毒疫苗HCLV株在PK-15細胞和PK-E0細胞中增殖的一步生長曲線中可以看出：病毒感染72h的培養(yǎng)液中其滴度達到最高值，隨后迅速下降。HCLV株在PK-E0細胞中從48h開始到72h的滴度比在PK-15細胞中的滴度要高。證明PK-E0細胞中的E0蛋白的大量表達增加了HCLV在細胞中的復制。 5.通過將PK-E0細胞連續(xù)傳代30代，在連續(xù)觀

8、察期間發(fā)現(xiàn)PK-E0細胞在形態(tài)、貼壁生長等方面均沒有變化，證明獲得的PK-E0細胞是穩(wěn)定的。 6.在PK-15細胞上連續(xù)傳代獲得的HCLV，從第1到第25代病毒的測序結(jié)果一致，同源性為100％。從第26代開始在12-nt(ttttttctttttt)插入處出現(xiàn)變化，第26、27代在69位的堿基C的左右各多插入了一個T；第28、29代在堿基C的右側(cè)多插入了多2個T；第30、31代在C的左側(cè)多插入了多6個T，堿基C也變成了T；第32