miR-29a靶向Csda促進(jìn)PC12凋亡的機(jī)制研究.pdf

1、MicroRNA（miRNA）是一種大小約21～23個(gè)堿基的單鏈小分子RNA，它由DNA非編碼區(qū)域轉(zhuǎn)錄，在進(jìn)化中高度保守，其表達(dá)既具有時(shí)空特異性，也具有組織和細(xì)胞特異性。miRNAs通過與mRNA的3'端UTR序列互補(bǔ)而抑制其翻譯，因而廣泛的參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、發(fā)育等生理病理過程。隨著對(duì)miRNA認(rèn)識(shí)的不斷深入，發(fā)現(xiàn)miRNA在神經(jīng)系統(tǒng)的損傷過程中也起到了至關(guān)重要的作用。細(xì)胞凋亡是神經(jīng)損傷的重要形式，已有研究表明miRNA參與神經(jīng)細(xì)胞

2、的凋亡過程，Chen等發(fā)現(xiàn)miR-21在人類惡性腦膠質(zhì)瘤中普遍高表達(dá)，通過抑制miR-21的表達(dá)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡明顯增多，李朝輝等利用過氧化氫誘導(dǎo)PC12細(xì)胞模型，檢測(cè)到凋亡前后多個(gè)miRNA表達(dá)譜都發(fā)生了變化。
　　本實(shí)驗(yàn)室前期通過miRNA芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bonemarrowmesenchymalstemcells，BMSCs)向神經(jīng)細(xì)胞分化后，miRNAs的表達(dá)譜發(fā)生明顯改變，其中miR-29a的表達(dá)量較分化前增

3、高最為明顯。之后通過慢病毒介導(dǎo)miR-29a在大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中高表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-29a有促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的凋亡及抑制其增殖的作用[1]。也有研究表明，miR-29a靶向DNMT1，DNMT3a，DNMT3b，Mcl-1，YY1andCDK6[2-4]促進(jìn)凋亡，它們也是依賴p53的方式誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。我們利用生物信息學(xué)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)冷休克蛋白(Cold-ShockDead-boxproteinA，CSDA)也可能是miR-29a靶基

4、因，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡，但目前尚未有實(shí)驗(yàn)證實(shí)。
　　在環(huán)境溫度發(fā)生明顯改變時(shí)，生物體會(huì)產(chǎn)生某種蛋白來調(diào)節(jié)機(jī)體功能，以適應(yīng)溫度變化。比如，在環(huán)境溫度降低時(shí)機(jī)體會(huì)在低溫的刺激下產(chǎn)生一些蛋白來適應(yīng)環(huán)境變化，該類蛋白統(tǒng)稱為“冷休克蛋白”(coldshockproteins，CSPs)[5]。迄今為止，CSPs已經(jīng)在微生物、植物及動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，而且已證實(shí)CSPs在核酸結(jié)構(gòu)以及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上具有較高的同源性，且高度保守[6]。冷休克蛋白CSD

5、A是DeadBox蛋白家族中非常重要的一種蛋白，常溫下表達(dá)量極低，而在低溫時(shí)大量表達(dá)，具有RNA酶解旋活性，是核糖體結(jié)合蛋白，其功能與細(xì)胞增殖、分化、凋亡有關(guān)。
　　PC12細(xì)胞是大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻瘤分化細(xì)胞株，具有神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的一般特征，被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)生理和神經(jīng)藥理學(xué)研究。本研究以慢病毒介導(dǎo)miR-29a前體在PC12細(xì)胞中高表達(dá)，通過H2O2誘導(dǎo)PC12凋亡為模型，探索mir-29a靶向CSDA基因促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，進(jìn)一

6、步豐富mir-29a促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的理論。
　　目的：
　　建立高感染效率、穩(wěn)定的過表達(dá)miR-29a的PC12細(xì)胞株，探索miR-29a靶向CSDA基因促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，進(jìn)一步豐富miR-29a促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的理論。
　　方法：
　　1.慢病毒的包裝。293T細(xì)胞復(fù)蘇和擴(kuò)增，按照復(fù)能基因的慢病毒包裝試劑的操作步驟，分別包裝miR-29a前體表達(dá)病毒載體(Lvx-miR-29a-eGFP)、空白對(duì)照載體(L

7、vx-eGFP-control)，48h收獲病毒上清。
　　2.慢病毒感染PC12細(xì)胞及抗性篩選。感染前一天傳代PC12細(xì)胞至6孔板，加入200μl的病毒上清感染PC12細(xì)胞，48h后加入抗性培養(yǎng)基進(jìn)行兩周的篩選。
　　3.實(shí)驗(yàn)分組:miR-29a過表達(dá)組，空質(zhì)粒對(duì)照組，200μmol/LH2O2+miR-29a過表達(dá)組，200μmol/LH2O2+空質(zhì)粒對(duì)照組，200μmol/LH2O2+空白對(duì)照組。
　　4.流式細(xì)

8、胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡的變化，H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞10h后檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡率。
　　5.提取各組細(xì)胞的RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，real-timePCR檢測(cè)預(yù)測(cè)miR-29a調(diào)控靶基因表達(dá)的變化。提取各組細(xì)胞的蛋白，Westernblot檢測(cè)相應(yīng)靶蛋白的變化。
　　6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)值用樣本均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(X)±S）表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較兩組間差異，以α=0.

9、05為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。
　　結(jié)果：
　　1.慢病毒包裝。293T細(xì)胞貼壁呈類圓形或多角形，排列整齊。包裝后48h收獲Lvx-miR-29a-eGFP和Lvx-eGFP-control病毒上清。
　　2.感染PC12細(xì)胞及抗性篩選。在病毒感染后的PC12細(xì)胞狀態(tài)略差，加入篩選培養(yǎng)基后未被病毒感染的細(xì)胞大量死亡，一周后存活的細(xì)胞開始形成克隆，篩選兩周后形成穩(wěn)定的細(xì)胞系，分別命名兩組細(xì)胞PC12-miR-29a，PC12-eGFP

10、，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)感染率miR-29a過表達(dá)組為75.2％，空質(zhì)粒對(duì)照組為69.8％。
　　3.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡率，miR-29a過表達(dá)組凋亡率3.267±0.551％，空質(zhì)粒對(duì)照組1.867±0.203％，miR-29a過表達(dá)促進(jìn)PC12細(xì)胞凋亡(P＜0.05);200μmol/LH2O2+miR-29a過表達(dá)組的凋亡率為41.2±3.54％，300μmol/LH2O2+空質(zhì)粒對(duì)照組12.77±0.35％，200μmo

11、l/LH2O2+空白對(duì)照組13.59±1.83％，在H2O2的誘導(dǎo)下空質(zhì)粒對(duì)照組與空白對(duì)照組凋亡率的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，而與空質(zhì)粒組相比，miR-29a過表達(dá)時(shí)經(jīng)過H2O2誘導(dǎo)后PC12細(xì)胞的凋亡率顯著增加(P＜0.001)。
　　4.通過RT-qPCR檢測(cè)miR-29a下游靶基因，用相對(duì)定量的方法（2-ΔΔCt）計(jì)算miR-29a過表達(dá)組與空質(zhì)粒對(duì)照組靶基因表達(dá)的的差異，miR-29a過表達(dá)時(shí)CSDA表達(dá)量下降(

12、miR-29a過表達(dá)組是空質(zhì)粒對(duì)照組0.829倍，P＜0.001)，而Notch1，adam19，zfp91的表達(dá)量均升高（分別是miR-29a過表達(dá)組是空質(zhì)粒對(duì)照組1.235倍，1.474倍，1.835倍，P＜0.001）。
　　5.當(dāng)200μmol/LH2O2誘導(dǎo)10h后，各組CSDA表達(dá)量與相對(duì)應(yīng)的未加H2O2組比較均顯著降低，其中H2O2+miR-29a過表達(dá)組CSDA是miR-29a過表達(dá)組的0.52倍，P＜0.001，

13、H2O2+空質(zhì)粒對(duì)照組為0.67倍;在H2O2誘導(dǎo)凋亡后miR-29a過表達(dá)組CSDA表達(dá)量下降程度高于空質(zhì)粒對(duì)照組（0.90倍，p＜0.05）。
　　6.WesternBlot結(jié)果顯示，H2O2誘導(dǎo)10h后，CSDA蛋白的表達(dá)量與H2O2陰性組相比明顯下降;而過表達(dá)miR-29a是CSDA蛋白的表達(dá)量與空質(zhì)粒對(duì)照組相比也顯著降低。
　　結(jié)論：
　　1.miR-29a靶向抑制CSDA在PC12細(xì)胞中的表達(dá)，并促進(jìn)細(xì)胞凋